研究HPLC同步測定禿瘡花中紫堇丁堿同分異構(gòu)體含量的方法。采用工業(yè)乙醇超聲輔助法提取禿瘡花全草干粉制得乙醇提取物,用等量石油醚和氯仿溶劑依次萃取,氯仿相采用柱層析法同步分離得到紫堇丁堿同分異構(gòu)體,采用HPLC測定其含量。

色譜條件:采用HPLC (E2695 Waters, 1525-2707 TCM-2489)、柱型C18 (250 mm×4.6mm, 5μm),甲醇(A)-水(B)為流動相,梯度洗脫(0～5 min, 10%A; 5～35 min, 10%A→100%A; 45～48 min, 100%A→10%A, 48～50 min, 10%A),上樣量1 mL,進(jìn)樣體積10μL,每個樣品運行檢測時間50 min;柱溫30℃,檢測波長260nm。結(jié)果表明,禿瘡花中紫堇丁堿含量為0.79%,異紫堇丁堿含量為1.33%。紫堇丁堿和異紫堇丁堿是禿瘡花酸化氯仿相的主要活性成分,其同步富集工藝及HPLC同時檢測方法未見報道,試驗為定量測定藥食同源植物中單體化合物的含量奠定試驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

禿瘡花[Dicranostigma leptopodum(maxim.)Fedde,DLF]，又名滇川禿瘡花、禿子花、紅茂草、勒馬回（陜西），屬于罌粟科禿瘡花屬。帶根全草民間供藥用，春夏采集，曬干；性涼，苦澀味，有毒；有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲的功效；用于治療扁桃體炎、牙痛、咽喉痛、淋巴結(jié)核，主治咽喉痛、扁桃體炎、齒齦腫痛、禿瘡、瘰疬、癤瘡、尋常疣、疥癬、癰疽、頭癬、體癬等。

現(xiàn)代藥理研究證明，傳統(tǒng)中草藥禿瘡花提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、殺蟲等多種藥理活性]。禿瘡花化學(xué)成分主要為多種異喹啉類生物堿。其中，生物堿包括阿樸啡型、原小檗堿型、原阿片堿型，對癌細(xì)胞系如SMCC-7721、A549、HT-29、KB和p388等癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可抑制癌細(xì)胞增殖，可能是禿瘡花抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

工藝研究指出異紫堇丁堿在該植物中的含量較高[7]，并且具有強(qiáng)的抗腫瘤活性。然而有關(guān)同步提取分離和HPLC同步測定紫堇丁堿同分異構(gòu)體的方法未見文獻(xiàn)報道。試驗采用超聲提取法和硅膠柱層析法分離純化紫堇丁堿和異紫堇丁堿，通過HPLC同時測定其含量，以期為禿瘡花的有效利用和資源開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

禿瘡花為花期全草，2018年5月采自陜西省西北農(nóng)林科技大學(xué)北校園區(qū)。經(jīng)過西北農(nóng)林科技大學(xué)苗芳教授鑒定為禿瘡花（Dicranostigma leptopodum(Maxim.)Fedde）。自然風(fēng)干，粉碎后用孔徑0.150 mm篩篩分，密封，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試驗試劑

甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、氨水、氫氧化鈉等（分析純，天津市津東天正精細(xì)化化學(xué)試劑廠，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；48～74μm氧化鋁、GF254薄層層析硅膠、74～149μm和48～74μm柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；0.5%CMC、110℃活化GF254薄層層析硅膠（自制）；羧甲基纖維素鈉（CMC）（南京化學(xué)試劑公司）；75%乙醇、95%工業(yè)乙醇（山東安捷高科公司）；色譜純甲醇（德國默克）；超純水（上海和泰）。

1.3 主要試驗儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JPCT-20L型超聲提取器（無錫久平儀器有限公司）；WFH-203三用紫外分析儀（上海光譜儀器有限公司）；BC-R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；HPLC(Waters公司）；C-18反相色譜柱（Merk公司）；CP224C萬分位電子分析天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；YP30002電子天平（上海越平科學(xué)儀器蘇州制造有限公司）。

E2695 Waters高效液相色譜儀；1525-2707 TCM-2489色譜系統(tǒng)（Water 1525 Binary HPLC Pump,Water2707 Autosampler,Water 2489 UV/Visible Detector）；柱型C18(250 mm×4.6 mm,5μm),Breeze電腦程序系統(tǒng)。

1.4 提取分離試驗方法

將禿瘡花全草藥材干燥粉碎，取其干粉400 g，用2 000 m L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，在常壓下按照1︰5(g/m L）的固液比超聲波提取3次，45℃，每次1 h，過濾，合并濾液，50℃減壓回收溶劑，制得乙醇提取物用水充分混懸后，依次用極性由小到大的不同溶劑萃取。用等量石油醚溶劑連續(xù)萃取3次，混合萃取液，并減壓蒸餾除去石油醚溶劑，得石油醚萃取相浸膏，剩余水相，加入鹽酸進(jìn)行酸化（p H 1～2），用等量氯仿溶劑萃取3次，合并萃取液，減壓除去氯仿溶劑，得酸化氯仿相。取1.00 g禿瘡花酸化氯仿相，用48～74μm硅膠柱層析和中性Al2O3柱層析（規(guī)格：35 mm×280 mm），洗脫劑依次為V(CHCl3）︰V(CH3OH)=15︰1～8︰1，分離得到196.9 mg紫堇丁堿和488.6 mg異紫堇丁堿[8]。紫堇丁堿占酸化氯仿相的19.7%，異紫堇丁堿占酸化氯仿相的48.9%，兩者合計共占酸化氯仿相的68.6%，是酸化氯仿相的主要有效成分。

2 含量測定

2.1 供試樣品及濃度配制

實時提取物：稱取5 g禿瘡花全草粉末，用95%工業(yè)乙醇，于50℃超聲提取，提取3次，每次1 h，制得0.855 g醇提物，命名為TCH-1。

禿瘡花中生物堿類化合物紫堇丁堿（Cor）、異紫堇丁堿（Iso-Cor）均為研究分離、提取和純化的單體化合物。

稱取相應(yīng)量的醇提物和單體化合物，用色譜甲醇溶解，并用0.22μm超濾膜過濾，配制成相應(yīng)濃度的甲醇溶液。生物堿單體化合物濃度和醇提物濃度配制梯度見表1和表2所示。

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