植物寄生線蟲是制約全球糧食生產(chǎn)的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界因植物寄生線蟲造成的損失約800億美元，其中根結(jié)線蟲廣泛分布于世界各地，是危害極大的一類植物寄生線蟲。目前根結(jié)線蟲的防治措施包括種植抗病品種、使用化學(xué)殺線劑、輪作、生物防治等，其中線蟲種類鑒定是各類防治措施實(shí)施的基礎(chǔ)。

梔子又名黃梔子，屬茜草科梔子屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，不僅可以直接入藥，其果實(shí)還是提取食用色素添加劑“黃色素”的天然優(yōu)質(zhì)材料。梔子分布于廣西、河南、浙江、江西、福建、湖北等地，種植梔子可促進(jìn)產(chǎn)地農(nóng)民增收，是目前廣西賀州、柳州等地產(chǎn)業(yè)扶貧的有效途徑。然而，梔子生產(chǎn)面臨嚴(yán)重的病害問(wèn)題，其中根結(jié)線蟲病是其中一種重要的病害，在不同地區(qū)均有不同程度發(fā)生。熊英等、賈全全等、李冬等等相繼在廣西柳州、江西等地發(fā)現(xiàn)該病害，但多數(shù)研究集中于病害發(fā)生情況調(diào)查及藥劑篩選方面，病原相關(guān)報(bào)道較少，僅有廣西柳州、福建福鼎兩地對(duì)其病原進(jìn)行了鑒定。2018—2020年對(duì)廣西賀州市的梔子種植基地進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)梔子受到根結(jié)線蟲的危害，呈現(xiàn)植株長(zhǎng)勢(shì)差，葉片黃化、萎蔫、根系形成大量根結(jié)等癥狀，嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)貤d子種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究對(duì)采集到的梔子根系及其根際土壤進(jìn)行分離，對(duì)分離得到的根結(jié)線蟲二齡幼蟲及雌蟲進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定，旨在明確梔子根結(jié)線蟲病病原種類，為該病的有效治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲的采集及分離

線蟲樣本采自賀州市八步區(qū)蓮塘鎮(zhèn)旗頭嶺文坡村、上寺村梔子種植基地，采用五點(diǎn)取樣法挖取呈現(xiàn)根結(jié)線蟲病癥狀的梔子根系及其根際土壤帶回實(shí)驗(yàn)室。在解剖鏡下，從根結(jié)挑取單卵塊放置25℃恒溫箱孵化成二齡幼蟲，將二齡幼蟲接種于預(yù)先培植于消毒土的梔子（賀梔1號(hào)）根部，進(jìn)行活體保存，待用。試驗(yàn)時(shí)挖取根結(jié)線蟲病癥狀明顯的梔子根系及根際土壤，采用直接解剖法分離雌蟲，將根系置于體視鏡下用3號(hào)昆蟲針挑取雌蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；根際土壤采用改良貝曼漏斗法進(jìn)行分離，25℃靜置24h后，用小玻璃瓶收集約10mL線蟲懸浮液。在體視鏡下將根結(jié)線蟲二齡幼蟲從線蟲懸浮液中挑出，經(jīng)熱殺死后制成臨時(shí)玻片用于形態(tài)觀察。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

二齡幼蟲及雌蟲主要形態(tài)特征：使用尼康顯微鏡觀察其頭部、口針、尾部特征，并采用deMan公式對(duì)20條二齡幼蟲進(jìn)行測(cè)量，分別測(cè)量體長(zhǎng)、最大體寬、口針長(zhǎng)度、尾長(zhǎng)、透明尾長(zhǎng)和DGO（背食道腺開口至口針基部球的距離）等形態(tài)指標(biāo)。

會(huì)陰花紋的制作及觀察：參照張紹升的方法，從梔子根組織挑取成熟雌蟲，放置滴有10μL40%乳酸的載玻片上，在體視顯微鏡下用手術(shù)刀切取蟲體后部約1/4并將體內(nèi)組織去除，用鑷子將會(huì)陰花紋轉(zhuǎn)移至滴有10μL純甘油的載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察拍照。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 線蟲DNA提取

線蟲DNA抽提采用單條線蟲DNA提取法。參照王江嶺等的方法略有改動(dòng)，在經(jīng)滅菌的凹面皿上滴入16μLddH2O和2μL10×PCRBuffer混合液，用挑蟲針將單條根結(jié)線蟲二齡幼蟲挑入混合液中，取1號(hào)昆蟲針將線蟲切成2～3段，用移液器將含有線蟲段的所有混合液轉(zhuǎn)移至200μLPCR管中，加入2μL（1mg/mL）蛋白酶K，-80℃超低溫冰箱放置20min，65℃溫育60min，95℃加熱10min，獲得DNA提取液。DNA提取液可立即用于PCR擴(kuò)增或放入–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增

核糖體ITS區(qū)采用引物F194:5'-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3'和PXB481:5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'進(jìn)行擴(kuò)增，28SrDNAD2D3區(qū)采用通用引物D2A:5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3'和D3B:5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：TaKaRaTaqHSPerfectMix(2×)25μL，上游引物（10μm）2μL，下游引物（10μm）2μL，模板DNA2μL，ddH2O19μL。擴(kuò)增條件：94℃4min；94℃40s，55℃40s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后725min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%Agarose膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測(cè)序。

1.3.3 序列分析

PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果用NTI11軟件進(jìn)行序列拼接，最終序列上傳至GenBank，序列號(hào)分別為MH756121、MH756122、MN648519、MN648520。根據(jù)近年來(lái)發(fā)表的根結(jié)線蟲系統(tǒng)進(jìn)化文獻(xiàn)，從GenBank下載相關(guān)線蟲rDNA-ITS和28SrDNAD2D3序列，采用NTI11軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。

1.3.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA7.0軟件構(gòu)建基于rDNA-ITS及28SrDNAD2D3區(qū)的Neighborjoing系統(tǒng)進(jìn)化樹。分別選擇GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中象耳豆根結(jié)線蟲（M.enterolobii）rDNA-ITS序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969）和28SrDNAD2D3區(qū)序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969），南方根結(jié)線蟲（M.incognita）rDNA-ITS序列（LC030363），花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）rDNA-ITS序列（KJ572384、AF387092）和28SrDNAD2D3區(qū)序列（AF435803、KJ598135），爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）rDNA-ITS序列（AY438555、KX646187）和28SrDNAD2D3區(qū)序列（MT3412999、MN096736），巴拉那根結(jié)線蟲（M.paranaensis）28SrDNAD2D3區(qū)序列（AF435800、KY911103），擬禾本科根結(jié)線蟲（M.graminicola）28SrDNAD2D3區(qū)序列（MG273441、MG273443），分別以朱頂紅短體線蟲（Pratylenchushippeastri,FJ712935）和玻利維亞短體線蟲（P.crenatus,MH973647）作為外類群，rDNA-ITS共計(jì)15條序列，28SrDNAD2D3區(qū)共計(jì)17條序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以自展法（bootstrap）進(jìn)行1000次循環(huán)檢測(cè)。

相關(guān)鏈接：蛋白酶K，土壤，乳酸

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