羅望子（TamarindusindicaL.），又名酸角，屬豆科，是一種高大常綠喬木，多見于我國西南省份且多呈半野生狀態(tài)。羅望子的營養(yǎng)價值豐富，其種皮富含單寧、色素；果肉富含多糖、有機(jī)酸等營養(yǎng)成分；種仁則以蛋白質(zhì)、多糖及脂肪等為主要成分，其中多糖約占種仁的60%，常作為增稠劑和穩(wěn)定劑應(yīng)用在食品、飲料及煙草工業(yè)上，而對于提取多糖后殘?jiān)木C合利用研究甚少。探究羅望子種仁多糖提取后殘?jiān)臓I養(yǎng)成分并對其進(jìn)行綜合利用，從而實(shí)現(xiàn)種仁產(chǎn)業(yè)鏈的延長刻不容緩。

Reddy等研究表明提取多糖后的羅望子種仁殘?jiān)腥院胸S富的蛋白質(zhì)，在印度、蘇丹等酸角主產(chǎn)國常被開發(fā)成飼料。我國雖然盛產(chǎn)羅望子，然而對其科學(xué)研究起步較晚且由于提取種仁多糖后的殘?jiān)糠趾叙こ硇缘牟灰准庸さ臍堄喽嗵?，因而在工業(yè)上常當(dāng)作廢料處理，這不僅污染環(huán)境，而且資源大量浪費(fèi)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能息息相關(guān)，其氨基酸構(gòu)成、分子質(zhì)量的大小、形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)等因素對蛋白質(zhì)的功能和理化性質(zhì)均有較大的影響，如蛋白質(zhì)的肽鍵及氨基酸側(cè)鏈能夠顯著影響其溶解性，而其乳化性質(zhì)受到自身分子大小及表面親疏水性等因素的影響。自上世紀(jì)70年代以來，眾多學(xué)者相繼測定了羅望子種仁的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)羅望子種仁中蛋白含量高達(dá)19.4%，且以種仁球蛋白（Tamarindseedglobulin，TSG）和白蛋白為主，TSG中含有18種氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸含量較高。此外，TSG的氨基酸種類齊全，評分較高，必需氨基酸指數(shù)為71.5，除蘇氨酸和酪氨酸外其它6種必需氨基酸俱全，尤以賴氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸最為豐富。上述研究證實(shí)羅望子種仁蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，具有較強(qiáng)的開發(fā)價值。目前對于羅望子種仁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能特性及其構(gòu)效關(guān)系尚未見研究報道。本文以羅望子種仁提取多糖后的殘?jiān)鼮樵?，提取羅望子種仁球蛋白，通過電泳、巰基二硫鍵含量及氨基酸組成等分析指標(biāo)對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并測定其溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性，研究其構(gòu)效關(guān)系，為日后TSG的功能注釋及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅望子種仁提取多糖后殘?jiān)?，來自云南貓哆哩集團(tuán)食品有限責(zé)任公司；大豆分離蛋白，購于山松生物制品有限公司；九三非轉(zhuǎn)基因一級大豆油，購于九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司。檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純），購于哈爾濱市化工試劑廠；SDS、TEMED、丙烯酰胺、甲醇、冰醋酸、亞甲基雙丙烯酰胺（均為分析純），購于天津市志遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖凝膠SephadexG-50，購于Summus公司；考馬斯亮藍(lán)R-250（分析純），購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-135粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；TDL-4A離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；722紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；DYY-7C垂直電泳儀，北京市六一儀器廠；ThermoUltiMate3000高效液相色譜儀，上海硅儀生化科技有限公司；FJ300高速均質(zhì)乳化機(jī)，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅望子種仁蛋白的提取

羅望子種仁提取多糖后的殘?jiān)袣埩舳嗵呛繛椋?.86±0.45）%，采用超聲輔助堿溶酸沉法從殘?jiān)刑崛SG，將去除多糖的沉淀與pH7.4的Tris-HCl緩沖液混合配置為質(zhì)量濃度為25g/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為12.5，使用恒溫磁力攪拌器于65℃下攪拌1.5h后放入250W超聲清洗器內(nèi)超聲1h，超聲后的溶液在4000r/min的條件下離心15min，上清液備用，沉淀重復(fù)上述步驟。合并上清液，調(diào)節(jié)pH值為TSG的等電點(diǎn)4.6靜置30min后，于8000r/min離心10min，所得沉淀即為粗TSG。再通過Osborn法將提取過TSG的沉淀與去離子水混合（33.3g/L），使用恒溫磁力攪拌器室溫攪拌1h，于8000r/min離心15min，所得上清液即為清蛋白，保留沉淀繼續(xù)提取鹽溶蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白，提取操作同上，但所用溶劑不同，依次為5%的NaCl溶液、70%乙醇和0.25%的NaOH溶液。本試驗(yàn)主要對含量最高的，具有良好物化性質(zhì)的TSG進(jìn)行研究，因此將提取的粗TSG溶于去離子水調(diào)節(jié)至中性pH7.0再通過葡聚糖凝膠柱層析法純化，獲得高純度TSG，冷凍干燥用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 SDS-PAGE測定分子質(zhì)量

根據(jù)Laemmli等的方法，采用SDS-PAGE凝膠電泳測定制備的TSG分子質(zhì)量。配制12%分離膠，5%濃縮膠，采用垂直電泳裝置電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，通過凝膠呈像系統(tǒng)掃描，QuantityOne軟件分析。

1.3.3 巰基（SH）和二硫鍵（S-S）含量的測定

根據(jù)Wen等的方法稍加修改，對游離巰基含量進(jìn)行測定，0.5mL1mg/mLTSG溶液加入2.5mLTris-Gly緩沖液（含8mol/L尿素，pH8.0）和0.02mL4mg/mLDTNB快速混合，將其置于25.0℃水浴30min后用分光光度計(jì)測定在412nm處的吸光度值，使用公式（1）計(jì)算游離SH含量。

式中：A₄₁₂—412nm處吸光值；D—蛋白樣品稀釋倍數(shù)；C—樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

參考Wen等的方法并適當(dāng)修改，對二硫鍵含量進(jìn)行測定，0.5mL1mg/mLTSG溶液加入5mLTris-Gly緩沖液（含10mol/L尿素，pH8.0）和0.1mLβ-巰基乙醇，于25.0℃混合反應(yīng)1h，加入30mLTCA（質(zhì)量濃度120g/L）沉淀大分子蛋白并于10000r/min離心10min，重復(fù)3次，收集沉淀物溶于15mLTris-Gly緩沖液（含8mol/L尿素，pH8.0）中，加入0.15mLDTNB（4mg/mL）快速混合，將其置于25.0℃水浴30min，使用紫外分光光度計(jì)在412nm處測定吸光度值，進(jìn)行S-S含量的計(jì)算，公式如（2）所示。

式中：C_′SH—總巰基含量，μmol/g；C_SH—游離巰基含量，μmol/g。

1.3.4 氨基酸的測定

參照衛(wèi)陽飛等的方法取0.50g蛋白樣品加入10mL6mol/L的鹽酸，于110.0℃水解24h，抽濾，經(jīng)60.0℃反復(fù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3次，定容至10mL，過0.45μm的濾膜，樣品備用。

采用PITC柱前衍生氨基酸分析法對氨基酸含量進(jìn)行分析，精密量取800μL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于5mL離心管中。加入400μL1mol/L的三乙胺乙腈溶液，混勻，隨后精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液400μL，混勻后室溫放置1h，加入2mL正己烷，劇烈振搖，靜置10min，取下層溶液過0.22μm濾膜注入高效液相色譜儀中進(jìn)行色譜分析并記錄色譜圖；另精密量取樣品測定溶液400μL，測定方法同上，參照GB5009124-2016對氨基酸含量進(jìn)行計(jì)算。

相關(guān)鏈接：谷氨酸，丙烯酰胺，冰醋酸，三羥甲基氨基甲烷

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