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由2.2.1可知，重組蕃E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-gly5m在25℃誘導(dǎo)時酶活最高，故將重組菌在25℃分別誘導(dǎo)4、6、8、10h。離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖4（a）。重組菌在25℃誘導(dǎo)4h后，重組β-葡聚糖水解酶Gly5m總酶活達(dá)到最高，為1086U/mL，且此時胞外酶活也達(dá)到最高，為888U/mL。此外，重組菌在誘導(dǎo)時間超過4h后，總酶活開始下降，說明Glv5m不穩(wěn)定，開始降解。
由2.2.2可知，重組菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-bt3312在25℃誘導(dǎo)時酶活最高，故將重組菌在25℃分別誘導(dǎo)4、6、8、10h。離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖4(b)。重組菌在30℃誘導(dǎo)8h后，總酶活達(dá)到最高，為2355U/mL,且此時胞內(nèi)、胞外酶活均達(dá)到最高,分別為917、1438U/mL。此外，重組菌在誘導(dǎo)時間超過8h后，酶活開始下降，說明BT3312也不穩(wěn)定。
以未經(jīng)重組β-葡聚糖水解酶水解的酵母葡聚糖為對照，對3個實驗組水解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖5。兩種重組酶都有水解酵母葡聚糖的能力，且兩種重組酶可以同時添加共同發(fā)揮作用。比較3種水解方式所得產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BT3312水解后，所得產(chǎn)物相對分子質(zhì)量最大，推測原因可能是BT3312專一性水解β-1，6-糖苷鍵，而在酵母β-葡聚糖中，β-1，6-葡聚糖少，占10％～15％，因此通過BT3312水解后，所得產(chǎn)物中大部分的β-葡聚糖沒有水解，故相對分子質(zhì)量大。反之，Glv5m主要水解β-l，3-糖苷鍵，在酵母β-葡聚糖中，β-1，3-葡聚糖多，故經(jīng)Glv5m水解后，所得產(chǎn)物相對分子質(zhì)量更小。此外，當(dāng)BT3312和Glv5m共同水解時，水解最徹底，剩余的底物最少，推測原因是酵母β-葡聚糖中同時含有β-l，3-糖苷鍵和β-1，6-糖苷鍵，而β-l，6-糖苷鍵的存在可能會影響β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m發(fā)揮作用，故當(dāng)β-l，6-葡聚糖水解酶BT3312水解掉β-1，6-糖苷鍵后，Gly5m才能更好地發(fā)揮水解作用，使水解更加徹底。
酵母β-葡聚糖經(jīng)過Gly5m和BT3312單獨或共同水解后，溶解率均有增加，結(jié)果見圖6。添加相同酶量水解時，同時添加Glv5m和BT3312，水解產(chǎn)物溶解率增加量最多，從12％增加到50％，水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為12.5g/L。當(dāng)Gly5m和BT3312共同水解時，酵母葡聚糖水解最徹底，前后結(jié)果一致。當(dāng)只用Glv5m水解時，酵母葡聚糖溶解率提高了2.6倍，水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為11g/L；當(dāng)只用BT3312水解時，酵母葡聚糖溶解率提高了2.4倍。水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為10.25g/L。
酵母β-葡聚糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健食品和化妝品行業(yè)中，但因為其水不溶性，限制了它的應(yīng)用。作者在E.coli中表達(dá)了兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶，兩種酶不僅都有水解酵母β-葡聚糖的能力，而且可以同時發(fā)揮作用。通過兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶的水解作用，使得酵母β-葡聚糖溶解性增加，且結(jié)構(gòu)和活性不被破壞。但是，兩種水解酶在E.coli中表達(dá)量低,SDS-PAGE檢測分析中沒有明顯條帶，為進(jìn)一步提高表達(dá)量和酶活，可通過優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、構(gòu)建不同啟動子的表達(dá)系統(tǒng)等進(jìn)行嘗試表達(dá)。此外，作者對兩種酵母β-葡聚糖水解酶共同水解酵母葡聚糖以提高其水溶性只進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步提高水解效率，可以優(yōu)化水解條件、添加的酶活濃度以及兩種水解酶的比例。
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采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，具體方法和步驟參照試劑盒說明書。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析儀和Qubit熒光定量測定儀檢測基因組DNA的純度和濃度，并送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測序。經(jīng)電泳檢測合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長度約為350bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成文庫制備。
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本文以燕麥β-葡聚糖為原料，利用疏水性飽和脂肪酸—硬脂酸對其進(jìn)行酯化改性，得到兩親性燕麥β-葡聚糖酯。通過探究硬脂酸酰基咪唑活化液的添加量、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響，得出當(dāng)脂酸?；溥蚧罨禾砑恿?.50mL，反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時間5.0h時，酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度最大，為0.133。采用傅里葉紅外光譜及氫核磁共振分析技術(shù)對所得產(chǎn)物進(jìn)行表征，所得結(jié)果均證明此方法可成功制備兩親性燕麥β-葡聚糖酯。
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本文以燕麥β-葡聚糖為原料，利用疏水性飽和脂肪酸—硬脂酸對其進(jìn)行酯化改性，得到兩親性燕麥β-葡聚糖酯。通過探究硬脂酸?；溥蚧罨旱奶砑恿?、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響，得出當(dāng)脂酸?；溥蚧罨禾砑恿?.50mL，反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時間5.0h時，酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度最大，為0.133。采用傅里葉紅外光譜及氫核磁共振分析技術(shù)對所得產(chǎn)物進(jìn)行表征，所得結(jié)果均證明此方法可成功制備兩親性燕麥β-葡聚糖酯。
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本文以燕麥β-葡聚糖為原料，利用疏水性飽和脂肪酸—硬脂酸對其進(jìn)行酯化改性，得到兩親性燕麥β-葡聚糖酯。通過探究硬脂酸?；溥蚧罨旱奶砑恿俊⒎磻?yīng)溫度以及反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響，得出當(dāng)脂酸?；溥蚧罨禾砑恿?.50mL，反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時間5.0h時，酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度最大，為0.133。采用傅里葉紅外光譜及氫核磁共振分析技術(shù)對所得產(chǎn)物進(jìn)行表征，所得結(jié)果均證明此方法可成功制備兩親性燕麥β-葡聚糖酯。
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根據(jù)《中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法（試行）》的相關(guān)規(guī)定，中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會批準(zhǔn)發(fā)布《燕麥麩皮》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)編號為T/FDSA017—2021，自2021年10月1日起實施。
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