北方偉業(yè)計(jì)量集團(tuán)有限公司
水解條件：20mmol/LPBS緩沖液(pH7.5)，酵母葡聚糖4g/L，酶活10U/mL。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：第一組只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二組只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312；第三組同時(shí)添加等酶活的β-l，3-葡聚糖水解酶Glv5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。37℃下反應(yīng)12h，取樣分析。水解樣品使用孔徑0.22μL的濾膜過(guò)濾后，采用高效體積排阻色譜和多角度激光散射聯(lián)用進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。采用Ultmhydrogel刪色譜柱(300mm×7.8mm，美國(guó)沃特斯公司)、多角度激光散射檢測(cè)器(美國(guó)懷雅特公司)檢測(cè)和示差折光檢測(cè)器(美國(guó)懷雅特公司)檢測(cè)。條件：0.1mol/LNaN03溶液作為流動(dòng)相，流速恒定保持在0.6mL/min，柱溫保持在40℃，進(jìn)樣量為10μL。
水解條件：20mmol/LPBS緩沖液(pH7.5)，酵母葡聚糖25g/L，酶活200U/mL。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：第一組只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二組只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312；第三組同時(shí)添加等酶活的β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。37℃反應(yīng)12h，定時(shí)取樣。樣品于12000r/min離心10min，用蒽酮法測(cè)定上清液中的總糖質(zhì)量濃度。
以合成的gly5m為模板，引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大約2700bp的片段，見(jiàn)圖2(a)。
采用DNA純化回收試劑盒對(duì)單一凝膠片段進(jìn)行回收，回收后的gly5m片段與用BamHI和XhoI酶切后得到的線性質(zhì)粒pET-28a(+)-gly5m連接，轉(zhuǎn)化E.ColiJMl09，挑取轉(zhuǎn)化子交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，重組載體pET-28a(+)-gly5m構(gòu)建成功。
以合成的bt3312為模板,引物F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大約1600bp的片段，見(jiàn)圖2(b)。采用DNA純化回收試劑盒對(duì)單一凝膠片段進(jìn)行回收，回收后的bt33122片段與用BamHI和XhoI酶切后得到的線性質(zhì)粒pET-28a(+)-6bt3312連接，轉(zhuǎn)化E.ColiJMl09，挑取轉(zhuǎn)化子交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，重組載體pET-28a(+)-bt3312構(gòu)建成功。
將重組菌EcoliBL21(DE3)-pET-28a(+)-gly5m分另0在20、25、30℃下誘導(dǎo)12h，離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見(jiàn)圖3(a)。重組菌分別在20、25、30℃下誘導(dǎo)12h后，所得重組β-葡聚糖水解酶Glv5m總酶活分別為605、707、559U/mL。結(jié)果表明，溫度對(duì)重組β-葡聚糖水解酶Gly5m的酶活影響較小。另外,重組菌在30℃誘導(dǎo)12h后，Glv5m都分泌到胞外，細(xì)胞破碎上清液無(wú)酶活；在20、25℃誘導(dǎo)12h后，細(xì)胞破碎上清液中還存在少量重組β-葡聚糖水解酶。
將重組菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-gly5m分別在20、25、30℃下誘導(dǎo)12h后，離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見(jiàn)圖3(b)。重組菌在30、25、20℃下誘導(dǎo)12h后，所得重組β-葡聚糖水解酶BT3312總酶活分別為l652、1896、1888U/mL，25℃誘導(dǎo)時(shí)酶活最高。另外，重組菌在20℃誘導(dǎo)時(shí)，BT3312胞內(nèi)酶活最高。結(jié)果表明，溫度不僅影響B(tài)T3312的酶活，同時(shí)也會(huì)影響B(tài)T3312向胞外分泌。
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采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，具體方法和步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析儀和Qubit熒光定量測(cè)定儀檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度，并送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。經(jīng)電泳檢測(cè)合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約為350bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成文庫(kù)制備。
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本文以燕麥β-葡聚糖為原料，利用疏水性飽和脂肪酸—硬脂酸對(duì)其進(jìn)行酯化改性，得到兩親性燕麥β-葡聚糖酯。通過(guò)探究硬脂酸?；溥蚧罨旱奶砑恿?、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響，得出當(dāng)脂酸?；溥蚧罨禾砑恿?.50mL，反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間5.0h時(shí)，酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度最大，為0.133。采用傅里葉紅外光譜及氫核磁共振分析技術(shù)對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行表征，所得結(jié)果均證明此方法可成功制備兩親性燕麥β-葡聚糖酯。
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本文以燕麥β-葡聚糖為原料，利用疏水性飽和脂肪酸—硬脂酸對(duì)其進(jìn)行酯化改性，得到兩親性燕麥β-葡聚糖酯。通過(guò)探究硬脂酸?；溥蚧罨旱奶砑恿俊⒎磻?yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響，得出當(dāng)脂酸酰基咪唑活化液添加量6.50mL，反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間5.0h時(shí)，酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度最大，為0.133。采用傅里葉紅外光譜及氫核磁共振分析技術(shù)對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行表征，所得結(jié)果均證明此方法可成功制備兩親性燕麥β-葡聚糖酯。
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本文以燕麥β-葡聚糖為原料，利用疏水性飽和脂肪酸—硬脂酸對(duì)其進(jìn)行酯化改性，得到兩親性燕麥β-葡聚糖酯。通過(guò)探究硬脂酸酰基咪唑活化液的添加量、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響，得出當(dāng)脂酸?；溥蚧罨禾砑恿?.50mL，反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間5.0h時(shí)，酯化反應(yīng)產(chǎn)物取代度最大，為0.133。采用傅里葉紅外光譜及氫核磁共振分析技術(shù)對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行表征，所得結(jié)果均證明此方法可成功制備兩親性燕麥β-葡聚糖酯。
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根據(jù)《中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法（試行）》的相關(guān)規(guī)定，中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)批準(zhǔn)發(fā)布《燕麥麩皮》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為T(mén)/FDSA017—2021，自2021年10月1日起實(shí)施。
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