1.2.6 OGE的臨界聚集濃度

臨界聚集濃度的測定利用熒光探針法，方法參照文獻(xiàn)并稍作修改。準(zhǔn)備稱取芘標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度為3×10^-4mol/L的芘甲醇溶液。取10mL的具塞試管，每管中加入3×10^-4mol/L的芘甲醇溶液20μL后，用氮?dú)鈱⑷芤褐械募状即蹈?。選取不同取代度的OGE，再向每管中加入10mL不同取代度、不同濃度（0.0002～3mg/mL）的OGE溶液，此時(shí)芘的最終濃度為6×10^-7mol/L，室溫下避光高速攪拌5h后，利用熒光分光光度計(jì)測定芘的發(fā)射光譜。測定條件：激發(fā)波長330nm，發(fā)射和激發(fā)狹縫均為5nm，發(fā)射光譜的掃描范圍350～500nm。記錄I₁（374nm）和I₃（385nm）處的熒光強(qiáng)度。以O(shè)GE濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，I₁/I₃的值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，并進(jìn)行曲線擬合后，求兩擬合曲線交點(diǎn)處的橫坐標(biāo)，換算成濃度，此時(shí)的濃度即臨界聚集濃度。

1.2.7 OGE的溶解度

稱取一定取代度的OGE，配制成2.0mg/mL的溶液，將溶液于100℃下加熱15min后取出，離心20min（3000×g），收集上清液烘干稱重，并記錄，按式（2）計(jì)算其溶解度。

1.2.8 OGE的細(xì)胞毒性分析

從液氮罐中取出裝有Raw264.7細(xì)胞的凍存管1支，37℃水浴復(fù)蘇、傳代、定期換液等工作。試驗(yàn)開始前加入新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS）制成細(xì)胞懸液，1000×g離心5min后，棄上清后，加入新鮮培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞濃度調(diào)成3×10⁴個(gè)/孔的密度，以100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。置于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中過夜，使細(xì)胞充分貼壁，棄上清后，以100μL/孔加入不同濃度（25，50，100，200μg/mL）的OGE溶液至各孔中，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。在37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入10μLCCK-8液，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h左右，在波長450nm處測定吸光值（OD值）。

式中，A₁—試驗(yàn)孔吸光值（OD值）；A₂—對照空吸光值（OD值）；A₀—空白孔吸光值（OD值）。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)各數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。利用MestReNova軟件進(jìn)行NMR圖譜數(shù)據(jù)處理，SPSSStatistics24統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，采用單因素方差分析進(jìn)行各組間指標(biāo)差異比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥β-葡聚糖硬脂酸酯（OGE）的制備

2.1.1 硬脂酸活化液添加量對取代度的影響

有報(bào)道稱，脂肪酸酯化多糖的反應(yīng)是可逆的。因此，硬脂酸酰基咪唑的增加促使該酯化反應(yīng)向正方向不斷進(jìn)行。從圖1可以清晰地看出，隨著硬脂酸?；溥蛱砑恿坎粩嘣黾?，產(chǎn)物取代度也不斷增加。推測由于隨著硬脂酸酰基咪唑添加量的增加，燕麥β-葡聚糖與?；溥?/span>之間的碰撞頻率也隨之不斷增大，使得整個(gè)體系中的酯化效率相應(yīng)提高。繼續(xù)添加硬脂酸?；溥驎r(shí)，硬脂酸?；溥蚺c燕麥β-葡聚糖中的羥基基團(tuán)發(fā)生的反應(yīng)也慢慢趨于飽和，反應(yīng)速率減緩，取代度的增加趨勢也變得較為緩慢。
 

2.1.2 反應(yīng)溫度對取代度的影響

圖2是酯化反應(yīng)溫度對產(chǎn)物取代度的變化圖，其中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度從70℃升至80℃時(shí)，酯化產(chǎn)物的取代度從0.036增加至0.057后，繼續(xù)升高體系的反應(yīng)溫度，對酯化反應(yīng)的影響不是很大，取代度數(shù)值變化較小，并趨于平緩?？赡苡捎跍囟壬撸蠓肿渔湹幕钚砸蚕鄳?yīng)增強(qiáng)，促使反應(yīng)體系中分子間的有效碰撞次數(shù)增加，取代度隨之發(fā)生變化。當(dāng)反應(yīng)體系中參與反應(yīng)的分子達(dá)到飽和時(shí)，有效碰撞的次數(shù)不再增加，取代度的變化也趨于穩(wěn)定。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對取代度的影響

根據(jù)酯化反應(yīng)的理論分析結(jié)果，酯化反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間的延長逐漸達(dá)到一個(gè)極限值。如圖3所示，隨著酯化反應(yīng)時(shí)間的持續(xù)延長，取代度相應(yīng)升高，燕麥β-葡聚糖的酯化反應(yīng)也越充分。酯化反應(yīng)在4.5h前，由于體系中生成的OGE濃度較低，使得體系中的酯化反應(yīng)能夠持續(xù)進(jìn)行。而當(dāng)整個(gè)體系在反應(yīng)進(jìn)行到5.0h時(shí)，產(chǎn)物的取代度增長幅度變得緩慢，此時(shí)反應(yīng)體系中的酯化反應(yīng)與分解反應(yīng)即將平衡。因此，反應(yīng)時(shí)間并不能無限延長下去。

2.1.4 OGE制備條件的優(yōu)化

利用SPSSStatistics24軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用3因素3水平進(jìn)一步研究硬脂酸活化液添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）和反應(yīng)時(shí)間（C）對OGE取代度的影響，確定出OGE的最佳制備條件。

從表1中可以清楚的得到此反應(yīng)中OGE的最佳制備條件，即當(dāng)硬脂酸?；溥蛱砑恿繛?.50mL，反應(yīng)溫度為90℃，反應(yīng)時(shí)間為5.0h時(shí)，有最大取代度，為0.133。

2.2 OGE的外觀形態(tài)及粒徑

分別配制1mg/mL的燕麥多糖溶液和同質(zhì)量濃度的OGE溶液作對比可以看出，OGE溶液更為渾濁，且上層有很多泡沫存在，而燕麥多糖溶液則清澈，且?guī)缀鯚o泡沫存在。推測是由于在原燕麥β-葡聚糖中接入了硬脂酸，硬脂酸本身具備乳化、穩(wěn)定及潤滑作用有可能也帶入到OGE中，使得OGE液體上方出現(xiàn)諸多泡沫。

據(jù)相關(guān)報(bào)道，兩親性多糖在較低濃度下能夠形成殼核結(jié)構(gòu)的自聚集膠束，納米膠束的外觀形態(tài)大多呈球狀。如圖5所示，OGE在掃描電鏡下可以清晰地看出其外觀形態(tài)為球形，較原燕麥β-葡聚糖的粒徑更小，大小更為均一。原燕麥β葡聚糖有干癟狀的球形，而經(jīng)過改性后的兩親性多糖更加飽滿。

大多數(shù)兩親性多糖形成的膠束的PDＩ都非常窄。PDＩ值越小表示粒徑分布越窄，顆粒大小越均一。有研究表明，當(dāng)PDＩ＞0.7時(shí)，代表顆粒的粒徑分布較寬。正如表2所示，OGE的PDＩ＜0.7，可認(rèn)為OGE的粒徑大小較為均一，與掃描電鏡呈現(xiàn)的表觀形態(tài)一致。然而在不同取代度下，OGE的粒徑大小也存在差異，隨取代度的增加，OGE的粒徑大小反而降低。可能由于OGE本身形成的膠束體系中，不同取代度下的比表面積和表面能的差異，導(dǎo)致自發(fā)的粒子聚集程度不同所致。疏水改性后的多糖相比較原糖來說，即取代度為0時(shí)，粒徑更小，其PDＩ值也越小。

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