1.2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

取不同濃度的LCP溶液液各0.04mL，按試劑盒加入反應試劑一0.26mL、試劑二0.32mL、試劑三0.04mL、試劑四0.06mL，混勻，即為測定組。取等體積蒸餾水，同法制備對照組。依上述方法，不加試劑三，加蒸餾水補足體積，混勻，即為空白組。于37℃反應10min，轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿中，蒸餾水調(diào)零，570nm讀取各組吸光度值A，平行測定3次，以V_C為陽性對照組，如下公式（4）計算清除率。

式中：A₁：對照組吸光度值，A₂：測定組吸光度值，A₃：空白組吸光度值。

1.2.7.3 DPPH自由基清除能力的測定

分別吸取1.47mg/mL的LCP溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL，加80%甲醇補足至1mL，備用。取上述不同濃度的LCP溶液0.4mL，按試劑盒加入0.6mL工作液制，混勻，即得測定組。取0.4mL不同濃度的LCP溶液與0.6mL80%甲醇溶液為對照組。取0.4mL80%甲醇溶液與0.6mL工作液，充分混勻，即得空白組。室溫避光靜置30min使之充分反應，無水乙醇調(diào)零，于517nm讀取吸光度值A，每個濃度的樣品重復測定3次，取均值，以VC為陽性對照組，按公式（5）計算清除率。

式中：A₁：測定組吸光度值，A₂：對照組吸光度值，A₃：空白組吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用平均值±標準差表示，采用Designexpert8.0.6進行響應面實驗數(shù)據(jù)優(yōu)化，用SPSS26.0軟件進行方差分析，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

實驗結(jié)果見圖1（a），LCP得率先隨pH的增大而增大。推測在一定范圍內(nèi)，增大pH，因形成羧基離子和去質(zhì)子胺，蛋白質(zhì)分子中含有更高的負電荷排斥力，使蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用增加，而增加LCP的溶解度；亦可能是因偏離LCP的等電點，而增加LCP的溶解度，最終使LCP得率增大。pH6時LCP的得率為（2.23%±0.05%），而后LCP得率隨pH增大而減小。推測較高pH水平下提取樣品時，因增加淀粉及其他雜質(zhì)物質(zhì)的溶出，而稀釋LCP的濃度。且在堿性條件下，酚類化合物易從藥材中釋放并與蛋白質(zhì)共價結(jié)合而后快速氧化，導致提取物的顏色呈褐色。經(jīng)方差分析，P=0.002＜0.01，表明pH對LCP得率的影響有極顯著性。綜合考慮，選取提取液pH5～7進行響應面法優(yōu)化試驗。

從圖1（b）可發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)得率逐漸增加，這是由于隨著料液比的增大，溶液中分子擴散和碰撞速率加快，促進蛋白質(zhì)分子的溶解。當料液比在1:15～1:25（g/mL）范圍內(nèi)，得率逐漸下降，推測是由于料液比增大而致蛋白質(zhì)分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質(zhì)，同時一些可溶性雜質(zhì)溶解阻礙蛋白質(zhì)溶出，且不利于獲得純度較好的蛋白質(zhì)。經(jīng)方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比對LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進行響應面法優(yōu)化試驗。

從圖1（b）可發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)得率逐漸增加，這是由于隨著料液比的增大，溶液中分子擴散和碰撞速率加快，促進蛋白質(zhì)分子的溶解。當料液比在1:15～1:25（g/mL）范圍內(nèi)，得率逐漸下降，推測是由于料液比增大而致蛋白質(zhì)分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質(zhì)，同時一些可溶性雜質(zhì)溶解阻礙蛋白質(zhì)溶出，且不利于獲得純度較好的蛋白質(zhì)。經(jīng)方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比對LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進行響應面法優(yōu)化試驗。

在特定條件下，蛋白質(zhì)浸出需要一定時間達到平衡狀態(tài)；時間較短，分子擴散效率一定，蛋白質(zhì)溶出量有限；延長浸提時間蛋白質(zhì)得率呈下降趨勢，可能是由于蛋白質(zhì)長時間在堿性環(huán)境中會發(fā)生輕微水解和變性，而且時間延長也會增加非蛋白物質(zhì)浸出，影響蛋白質(zhì)進一步沉淀和蛋白制品的純度，且與同類豆類如豌豆、大豆和蠶豆相比，川芎富含不同的多糖，多糖與蛋白質(zhì)的相互作用可能導致川芎中提取蛋白的價值降低。經(jīng)方差分析，P=0.023＜0.05，表明提取時間對LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取提取時間1～2h進行響應面法優(yōu)化試驗。

2.2 響應面分析LCP提取工藝試驗結(jié)果

2.2.1 響應面法優(yōu)化實驗設計及結(jié)果

每組樣品平行測定3次，取平均值，并進行數(shù)據(jù)散點圖和統(tǒng)計分析。DesignExpert8.0.6軟件進行響應面設計及結(jié)果分析。結(jié)果如表3所示，得擬合方程為

y=2.28+0.18A+0.21B+0.19C−0.055AB+0.078AC+0.13BC−0.47A²−0.34B²−0.54C²。

2.2.2 方差分析結(jié)果

如表4所示，模型F=40.23，Pr＞F＜0.01，說明此回歸模型是極顯著的。方程失擬項F=0.89，Pr＞F＞0.05，失擬項相對于純誤差影響不顯著，說明回歸模型與實測值擬合度較好，適用性高，可以使用該回歸方程代替試驗真實點分析試驗結(jié)果。各因素的影響大小為：提取時間＜提取溶劑pH＜料液比。通過F檢驗來判定，概率P（F＞Fα）的值越小，則相應變量的顯著程度越高，對試驗指標的影響越大，P_A、P_B、P_C均小于0.01，說明提取時間、料液比、提取溶劑pH對LCP得率的影響極顯著。R²=0.9810，R²_Adj=0.9566，表示所建立的模型能夠很好地反映獨立變量和響應變量之間的關(guān)系。

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