植酸是一種重要的有機(jī)磷天然抗氧化劑，廣泛存在于谷類(lèi)和植物種子中。植酸作為抗氧化劑的應(yīng)用型研究報(bào)道越來(lái)越多。Munoz等研究報(bào)道天然的磷化合物植酸，可作為尿石癥的潛在抑制劑。Lv等研究發(fā)現(xiàn)植酸在帕金森病治療中起到一定的作用，顯著抑制MPTP誘導(dǎo)的黑質(zhì)（SN）多巴胺能細(xì)胞損失，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）。Thompson等研究證實(shí)了添加內(nèi)源植酸對(duì)減緩淀粉消化率和對(duì)豆科植物的血糖反應(yīng)能力有影響。抗壞血酸棕櫚酸酯是一種通過(guò)化合物合成的被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限定的抗氧化劑，已被藥品管理局（FDA）提議作為美國(guó)安全食品和天然二級(jí)食品抗氧化劑?？箟难嶙貦八狨ゾ哂锌寡趸钚?，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，其表現(xiàn)出生物活性，可用于治療腫瘤等多種疾病。Fathi等利用表面等離子共振技術(shù)研究牛血清白蛋白與抗壞血酸棕櫚酸酯之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們之間的結(jié)合會(huì)影響蛋白的構(gòu)象，從而可能干擾生物活性分子在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸棕櫚酸酯可用于協(xié)同抗腫瘤治療。

糖尿病是一種伴隨代謝和內(nèi)分泌紊亂的重大疾病。大多數(shù)糖尿病患者受到胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷的2型糖尿?。═2DM）的影響，并出現(xiàn)各種并發(fā)癥，包括大血管和微血管功能障礙等。通常治療T2DM的策略是飲食控制，適度運(yùn)動(dòng)，使用降血糖和降脂劑等。抑制α-葡萄糖苷酶是治療糖尿病的手段之一，有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性可減緩餐后血糖水平的提高。Kunyanga等研究表明植酸含量高的植物可有效抑制食品樣品中α-葡萄糖苷酶的活性，其抑制程度與植酸含量直接相關(guān)，而植酸含量可能對(duì)餐后血糖水平的潛在治療有協(xié)同作用。然而，植酸和L抗壞血酸棕櫚酸酯2種抗氧化劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)研究植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為這2種抗氧化劑功能性研究提供新思路，同時(shí)為開(kāi)發(fā)新型酶抑制劑用于治療糖尿病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

釀酒酵母的α-葡糖苷酶（EC3.2.1.20），美國(guó)Singma-Aidrich公司；阿卡波糖，上海麥克萊恩生化科技有限公司；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、對(duì)硝基苯（pNP），北京百靈威科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉（Na₂CO₃），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植酸、L-抗壞血酸棕櫚酸酯，上海陸廣生物科技有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。
SynergyH1全功能酶標(biāo)記儀器，美國(guó)BioTek儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴，上海恒世儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡糖苷酶的抑制效果

α-葡萄糖苷酶能使pNPG水解生成pNP，生成物在紫外吸收波長(zhǎng)405nm處具有最大吸收值?；衔飳?duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果測(cè)定方法根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)一步修改。α-葡萄糖苷酶的測(cè)活總體系為340μL，首先加入133μL0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合配制而成，pH6.8），加入10μL5U/mLα-葡萄糖苷酶稀釋液，隨后加入7μL不同濃度梯度的效應(yīng)物溶液，混合均勻后在37℃下孵育10min。加入20μL5mmol/L底物pNPG溶液，混合均勻后在37℃下孵育20min。170μL0.1mol/LNa2CO3終止反應(yīng)。取200μL混合液于96孔板中，采用SynergyH1全功能酶標(biāo)記儀器在405nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸收值。

待測(cè)效應(yīng)物為植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯，植酸濃度依次為0.15，0.16，0.17，0.18，0.19，0.20，0.205，0.21，0.215，0.220，0.230mol/L，L-抗壞血酸棕櫚酸酯濃度依次為0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6mmol/L，每個(gè)梯度下平行測(cè)定5次，得到不同效應(yīng)物濃度下最后反應(yīng)體系的吸收值。以α-葡萄糖苷酶剩余酶活的抑制率降低至50%時(shí)效應(yīng)物的濃度為即為ＩC50值。將沒(méi)有效應(yīng)物的反應(yīng)作為空白對(duì)照組。

2.2 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡糖苷酶的抑制機(jī)理

的抑制機(jī)理待測(cè)效應(yīng)物為植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯，效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的研究是基于抑制效果的測(cè)定方法。α-葡萄糖苷酶的濃度梯度為5，4，3，2，1U/mL，底物pNPG濃度為5mmol/L，測(cè)定效應(yīng)物在不同濃度下反應(yīng)體系的紫外吸收波長(zhǎng)。以酶的濃度梯度為橫坐標(biāo)，體系的反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)繪制機(jī)理圖，通過(guò)圖中曲線(xiàn)是否過(guò)原點(diǎn)來(lái)判定效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理。

2.3 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡糖苷酶的抑制類(lèi)型

待測(cè)效應(yīng)物為植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯，效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型的研究是基于抑制效果的測(cè)定方法。α-葡萄糖苷酶的濃度為5U/mL，底物pNPG的濃度梯度為5，3.9，2.8，1.7，1.1mmol/L，測(cè)定效應(yīng)物在不同濃度下反應(yīng)體系的紫外吸收波長(zhǎng)。以pNPG濃度梯度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，體系的反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk類(lèi)型圖，圖中曲線(xiàn)的交點(diǎn)位置判定效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型。通過(guò)二次作Dixon圖，計(jì)算抑制常數(shù)。

2.4 分子對(duì)接技術(shù)

分子對(duì)接技術(shù)可以進(jìn)一步探索效應(yīng)物與α葡萄糖苷酶的結(jié)合模式。PubChem中下載植酸和L-抗壞血酸棕櫚棕櫚酸酯的2D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式。通過(guò)Chem3DPro軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)保存為mol2格式。UniProt蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)檢索釀酒酵母α-葡糖苷酶的一級(jí)序列，訪(fǎng)問(wèn)代碼為P53341。選擇與靶標(biāo)具有72.4%序列同一性的釀酒酵母異麥芽糖酶（PDB編碼3AＪ7，1.38Å分辨率）的晶體結(jié)構(gòu)作為建模模板。使用MolecularOperatingEnvironment（MOE）同源構(gòu)建模型工具構(gòu)建釀酒酵母α-葡糖苷酶的3D結(jié)構(gòu)。將酶蛋白和效應(yīng)物能量最小化至0.05RMS梯度便于兩者對(duì)接。構(gòu)建的配體化合物和酶蛋白導(dǎo)入MOE軟件中同一窗口，通過(guò)Simulationdock將酶和配體進(jìn)行半柔性對(duì)接。對(duì)于每個(gè)配體，配體分子通過(guò)姿勢(shì)的扭轉(zhuǎn)形成多種構(gòu)象，盡可能穩(wěn)定的構(gòu)象與酶活性口袋結(jié)合。篩選出最好配體構(gòu)象與酶蛋白活性位點(diǎn)氨基酸殘基的結(jié)合模式和相互作用，并使用可視化工具PyMol程序顯示兩者結(jié)合的三維圖像。

2.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSSStatistics17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用OriginPro8.5軟件繪制圖形與分析。使用Chem3DPro軟件轉(zhuǎn)化3D結(jié)構(gòu)，使用MolecularOperatingEnvironment（MOE）軟件進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMol軟件觀(guān)察對(duì)接結(jié)果的結(jié)合模式。所有數(shù)據(jù)值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”。

3 結(jié)果與分析

3.1 效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制效果。效應(yīng)物對(duì)酶的相對(duì)剩余酶活的抑制率隨著效應(yīng)物濃度的增加而降低，當(dāng)植酸濃度達(dá)到0.195mol/L時(shí)，抑制率降低為71%，當(dāng)抑制率降低到50%時(shí)，植酸的濃度（ＩC50）為（0.207±3.137）mol/L。L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制酶活達(dá)到50%時(shí)，濃度為（0.39±0.00838）mmol/L。就ＩC50而言，L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于植酸?？赡苁怯捎贚抗壞血酸棕櫚酸酯頭部帶有酚羥基的苯基更容易與α-葡萄糖苷酶結(jié)合。阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制率ＩC50為658mmol/L，植酸的抑制效果沒(méi)有阿卡波糖的效果好，然而L-抗壞血酸棕櫚酸酯的抑制效果是阿卡波糖的上千倍。

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