同化激素是一類具有強(qiáng)的蛋白質(zhì)同化作用，可抑制異化或氧化代謝，提高蛋白質(zhì)沉積的甾體類物質(zhì)，具有重要的殘留毒理學(xué)意義。在養(yǎng)殖業(yè)濫用最普遍的主要有睪酮、甲基睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等。由于它們能提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉生產(chǎn)率，一些從業(yè)者在利益驅(qū)使下將其用作畜禽的促生長(zhǎng)劑。雄性激素可損害人的肝功能，影響心血管系統(tǒng)，傷害人體的生殖系統(tǒng)，引起內(nèi)分泌功能障礙等，過量攝入性激素還可能對(duì)青少年的神經(jīng)系統(tǒng)和心理行為發(fā)展造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。原農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第178號(hào)公告明確指出不得在動(dòng)物飼料和飲食中添加苯丙酸諾龍等藥物。但目前非法將這類藥物用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖上的報(bào)道仍時(shí)有發(fā)生。

國(guó)內(nèi)外主要采用液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物組織中的睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、司坦唑醇、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等同化激素。目前我國(guó)對(duì)于上述11種同化激素在豬肉、雞肉中的多殘留檢測(cè)報(bào)道相對(duì)較少，參考現(xiàn)有的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008[14]),本研究在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上對(duì)儀器參數(shù)和樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，擬建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),以期能夠同時(shí)測(cè)定雞肉、豬肉中睪酮等11種同化激素，為批量檢測(cè)樣品中睪酮等違禁藥物的殘留量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

睪酮、甲睪酮、群勃龍、諾龍、美雄酮、丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；勃地龍，美國(guó)CATO公司產(chǎn)品；丙酸睪酮、康力龍、黃體酮，中國(guó)食品藥品檢定研究所產(chǎn)品；苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)IL公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，德國(guó)Merk公司產(chǎn)品；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、無水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；Triple QuadTM4500液質(zhì)聯(lián)用儀，AB SCIEX公司產(chǎn)品，配Analyst1.6.3軟件；CPA225D電子天平，賽多利斯科學(xué)技術(shù)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；ST16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；JE1002電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司產(chǎn)品；R205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司公司產(chǎn)品；N-VEVAP 24位氮吹儀，美國(guó)Organomation公司產(chǎn)品；MS3普通型旋渦混合器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，Merck Millipore公司產(chǎn)品；WAT200677固相萃取裝置，Waters公司產(chǎn)品；Agilent C18固相萃取小柱(200 mg, 3 mL),美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1 同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制

準(zhǔn)確稱取睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍10 mg(按實(shí)際含量折算，精確至0.0001)置于10 mL容量瓶中，用純甲醇溶液溶解并稀釋，配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置-20℃下保存。

1.2.1.2 同化激素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

從配制好的同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中，各自取1.0 mL的同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，甲醇定容至20 mL,配制成50 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液，置-20℃下保存。用甲醇稀釋備用。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm);流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液；柱溫：37℃;進(jìn)樣體積：5 μL;流速：0.25 mL/min; 梯度洗脫程序：0 min～1 min, 30%～55% A;1 min～3 min, 55% A;3 min～6 min, 55%～98% A;6 min～12 min, 98% A;12 min～12.5 min, 98%～30% A;12.5 min～15 min, 30% A。質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI),正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);電噴霧電壓(IS)5500V,霧化氣壓力(GSl)65 psi, 輔助器流速(GS2)60 L/rain, 氣簾氣壓力(CUR)30 psi, 離子源溫度(TEM)550℃,碰撞室壓力(CAD)8 psi。去簇電壓、碰撞能量及定量離子對(duì)、定性離子對(duì)等參數(shù)見表1。

1.2.3 樣品測(cè)定

1.2.3.1 樣品制備

將雞肉、豬肉的可食用組織部分盡可能地去除筋膜和脂肪后，切成小塊，用絞肉機(jī)絞碎，置-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 樣品提取

精確稱取2 g(精確至0.001 g)勻漿好的組織于50 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL 甲醇-乙腈(1∶1,v/v),渦旋混勻，超聲提取10 min, 以6000 r/min 離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 聚丙烯離心管中，重復(fù)提取一次。合并提取液，置-20℃下，冷凍2 h。以10000 r/min, 離心10 min。

1.2.3.3 樣品凈化

將“1.2.3.2”中提取的上清液于37℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸至近干，加4 mL 30%乙腈水溶解，備用。將上述溶液加到C18固相萃取柱凈化(3 mL甲醇、3 mL水活化，6 mL 30%甲醇水淋洗),抽干后，加入4 mL乙腈洗脫，置-20℃下冷凍1 h。以15000 r/min, 離心10 min。于37℃水浴下氮?dú)饩徛蹈?。加? mL 30%乙腈復(fù)溶，渦旋2 min, 上清液過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.3.4 檢測(cè)限與定量限的測(cè)定

分別制備0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2 μg/kg的添加樣品，每個(gè)濃度重復(fù)3次，前處理后。經(jīng)UPLC-MS/MS檢測(cè)，從基質(zhì)添加樣品中檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的最小濃度為檢測(cè)限(limit of detection, LOD),被定義為信噪比S/N≥3。根據(jù)其檢測(cè)限以同樣的方法確定其定量限，基質(zhì)添加樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量為定量限(Limit of Quantitation, LOQ),被定義為S/N≥10。

1.2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取空白樣品7份，進(jìn)行前處理，制備空白基質(zhì)液。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用初始流動(dòng)相稀釋成1000、500、200、100、50、20、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。取空白基質(zhì)液對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行稀釋，制得濃度為100、50、20、10、5、 2、1 μg/kg的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次，共做3個(gè)批次。

1.2.3.6 回收率與精密度

準(zhǔn)確稱取2 g(精確至 0.001 g)空白基質(zhì)，添加適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 100 μL,制備成10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的添加濃度。每個(gè)添加濃度做5個(gè)重復(fù)，連續(xù)做3個(gè)批次，添加提取劑進(jìn)行提取，其他按照上述前處理方法進(jìn)行處理。同時(shí)制得10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用單點(diǎn)定量法，按照回收率計(jì)算公式計(jì)算各添加水平下的回收率。每組5個(gè)平行樣品回收率之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是批內(nèi)精密度(RSD),3個(gè)批次的添加樣品回收率之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是批間精密度(RSD)。

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