靈芝是一種寶貴的藥用真菌，其中以赤芝（又名紅芝）和紫芝的藥理價值最高，被視為珍貴的中藥材?；瘜W成分研究表明多糖和三萜類化合物為主要的藥效成分，其中靈芝三萜有強烈的藥理活性，可以起到抗氧化、抗腫瘤、調節(jié)免疫、抑制疼痛、抑制組織胺釋放等作用。

靈芝三萜化合物提取和純化方法很多，提取方法有超聲波輔助法、回流提取法、微波法、超臨界CO2提取法，純化方法有吸附色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法，其中回流提取法操作簡單、提取效率高，適合中小企業(yè)生產在線監(jiān)測。試驗所用材料靈芝發(fā)酵粉是以谷物為基質經靈芝固態(tài)發(fā)酵后精制而成，基質中淀粉等物質可能會對產品中三萜化合物的形成及三萜的結構產生影響，進而影響提取工藝，研究結果會為后期功效分析奠定基礎。

一、材料與方法

1、材料

靈芝發(fā)酵粉：以谷物為基質，經靈芝固態(tài)發(fā)酵后精制而成，由山西瑞芝生物科技有限公司提供。

2、儀器與試劑

DHG-9070A電熱鼓風干燥箱：上海恒科學儀器有限公司；UV754N紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TDL6M低速離心機：上海百典儀器設備有限公司；KQ-300GDV數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FW100微型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；BS-100A自動部份收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司；LC1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；TENSOR27傅立葉紅外光譜儀：德國布魯克公司；Cary5000紫外-可見-近紅外分光光度計：美國安捷倫公司；UV-A紫外分析儀：上海嘉鵬科技有限公司。

齊墩果酸標準品：安徽酷耳生物工程有限公司。200～300目柱層析硅膠：青島海洋化工廠生產；薄層層析硅膠板：煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司。

3、方法

（1）靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的提取與測定

參照陳飛的方法，以齊墩果酸標準品，于555nm處測定吸光度，制得的標準曲線回歸方程為y=57.516x-0.0114，R²=0.9993。

稱取2g靈芝發(fā)酵粉，加入適量一定濃度的乙醇浸泡一段時間后，在一定溫度下進行回流處理。回流后取出放冷，在20℃下以4000r/min離心10min，合并上清液。將上清液減壓濃縮至5mL，用移液管吸取1mL到試管中，分別加入0.3mL5%香草醛-冰醋酸溶液和1mL高氯酸，70℃水浴25min，冷水浴中冷卻，加入10mL冰乙酸，搖勻后測定。

在單因素試驗的基礎上，采用響應面BoxBehnken對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取工藝條件進行優(yōu)化。響應面試驗因素水平表見表1。

（2）靈芝三萜粗提物的分離純化和結構鑒定

①靈芝三萜粗提物的分離純化

將靈芝三萜粗提物經減壓濃縮后進行硅膠柱層析分離純化。第一次洗脫采用的洗脫劑為CHCl₃∶CH₃OH=90∶10，流速0.5mol/mL，每管2mL分部收集，薄層層析定性分析，選擇展開呈現相同斑點流分收集，將分離的流分進行二次洗脫分離。二次洗脫的洗脫劑為CHCl₃∶CH₃OH=20∶1，流速0.5mol/mL，每管3mL分部收集，逐管測定三萜含量。

②靈芝三萜化合物的HPLC純度鑒定

采用色譜柱：Agllent5TC-C18（2）250×4.6mm；柱溫為室溫；流動相為2%乙酸溶液-乙睛（70∶30）；流速1.0mL/min；進樣量20µL；檢測波長254nm。

③紫外光譜掃描

將靈芝酸溶于甲醇，以甲醇為空白試劑在190～370nm進行紫外光譜掃描。

④紅外光譜分析

以KBr壓片法進行紅外光譜分析。

4、數據處理方法

所有試驗重復3次，運用DPS軟件進行方差顯著性分析，Design-Expert軟件對響應面試驗數據進行二次模擬回歸分析。

二、結果與分析

1、靈芝三萜的提取工藝優(yōu)化

（1）乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響

由圖1可知，采用不同濃度的乙醇對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物浸提得率有極顯著影響（p＜0.01）。乙醇濃度為95%時，三萜得率最高。當乙醇濃度在95%以下時，三萜得率隨乙醇濃度的提高而提高，但當乙醇濃度大于95%時，三萜的浸提得率反而會下降。因此，后續(xù)試驗選擇95%乙醇進行提取。

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