四環(huán)素類抗生素作為一類廣譜抗生素被廣泛用于控制細(xì)菌感染，由于其化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，超量使用和不當(dāng)處理均會導(dǎo)致其在土壤、水體、食品中的殘留嚴(yán)重，給人類公共健康帶來重大威脅。檢測四環(huán)素類抗生素所采用的方法通常為高效液相色譜法、免疫分析法等，這些方法具有耗時(shí)長、操作步驟復(fù)雜、成本高等局限性，因而開發(fā)敏感、快捷、經(jīng)濟(jì)的檢測方法尤為重要。核酸適配體作為一種新型生物識別分子，具有親和力高、穩(wěn)定性強(qiáng)、制備成本低、特異性強(qiáng)等明顯優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)藥等多個領(lǐng)域，在四環(huán)素類抗生素的快速分析中占有重要地位。本文主要綜述了用于四環(huán)素類抗生素檢測的核酸適配體傳感器，主要包括熒光、比色、電化學(xué)、表面等離子體共振、表面增強(qiáng)拉曼光譜等適配體傳感器，并闡述了適配體傳感器最新研究進(jìn)展以及各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。 

引言
四環(huán)素類抗生素是一類廣譜抗生素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物，包括四環(huán)素(tetracycline，TC)、土霉素(oxytetracycline，OTC)和金霉素(aureomycin，AM)等。因四環(huán)素類抗生素具有良好的抗菌性能，且成本低廉、副作用小，被用于控制人類和動物的細(xì)菌感染，但其廣泛應(yīng)用導(dǎo)致土壤、水、牲畜以及奶制品等積累的四環(huán)素類抗生素通過食物鏈傳播到人體。四環(huán)素類抗生素在體內(nèi)的積累可能削弱人體的免疫系統(tǒng)、引起抗生素耐藥性等危害。對于過敏性體質(zhì)，四環(huán)素類抗生素的積累會引起過敏或中毒反應(yīng)，甚至抑制骨骼生長。為了減少其對人體健康造成危害，許多國家和團(tuán)體設(shè)定了食品中四環(huán)素類抗生素的最大殘留限量(maximum residue limits，MRL)，中國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定牛奶中四環(huán)素、土霉素和金霉素的最大殘留限量為0.10 mg/kg。目前，常見的四環(huán)素類抗生素檢測方法有免疫分析法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，但這些方法操作復(fù)雜，需要訓(xùn)練有素的操作人員，且耗時(shí)長。因此，建立快速、準(zhǔn)確、簡單和靈敏的四環(huán)素類抗生素檢測方法是非常必要的。

核酸適配體(aptamer，Apt)是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(system aticevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)從DNA或RNA隨機(jī)序列文庫中獲得，對特定靶標(biāo)具有識別和結(jié)合特性的短鏈核酸，具有性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、易于修飾和合成等優(yōu)點(diǎn)，且能夠與離子、毒素、抗生素、蛋白質(zhì)和病毒等眾多靶分子結(jié)合。通過將適配體與靶分子之間的識別和結(jié)合作用轉(zhuǎn)化為靈敏的光學(xué)、電化學(xué)等檢測信號建立的生物傳感技術(shù)在分析檢測領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注。本文綜述了檢測四環(huán)素類抗生素的適配體傳感器及最新進(jìn)展，以期為適配體傳感器的發(fā)展提供參考。

1 核酸適配體傳感器在四環(huán)素類抗生素檢測方面的應(yīng)用
生物傳感器一般以酶、抗體、生物組織、功能核酸等生物活性物質(zhì)為識別元件，以與目標(biāo)物間的特異性反應(yīng)所產(chǎn)生的信號作為信號元件，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的定性定量檢測。根據(jù)不同的傳感信號，生物傳感器可分為比色、熒光和電化學(xué)傳感器等。生物傳感器因利用生物活性物質(zhì)而具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，并且響應(yīng)速度快、體積小、易于操作，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。核酸適配體具有高度靈活且易于設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)，因此可用來建立多種多樣的生物傳感器。目前，四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素的適配體均已被篩選出來，具體信息如表1所示。篩選出來的適配體被越來越多地用于建立四環(huán)素類抗生素的檢測方法，目前已被建立的檢測方法如表2所示，主要有熒光、比色、電化學(xué)、表面等離子體共振、表面增強(qiáng)拉曼光譜等適配體傳感器。

1.1 熒光適配體傳感器
熒光適配體傳感器主要是根據(jù)適配體與目標(biāo)物結(jié)合引起體系熒光性能的變化而建立起來的傳感器。熒光變化值與目標(biāo)物濃度呈現(xiàn)一定的關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的定量檢測。根據(jù)熒光基團(tuán)和適配體的作用方式，可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型熒光適配體傳感器。

熒光分析法具有較高的靈敏度，但自身具有熒光的生物分子在自然界中并不常見，因此，適配體通常被標(biāo)記熒光基團(tuán)以產(chǎn)生可測量的信號。近幾年，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的傳感器被廣泛應(yīng)用于四環(huán)素類抗生素的檢測。適配體在與目標(biāo)物結(jié)合前后構(gòu)象發(fā)生變化，影響熒光供體和受體之間能量轉(zhuǎn)移效率，從而產(chǎn)生熒光信號變化。將熒光方法的高靈敏度與適配體的高選擇性結(jié)合，利用傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料以及碳點(diǎn)、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料等納米熒光材料，建立熒光傳感器。5-羧基熒光素(fluorescein amidite，F(xiàn)AM)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、Cy3、Cy5等熒光基團(tuán)常用于標(biāo)記型適配體傳感器，以實(shí)現(xiàn)熒光信號的輸出?；跓晒饣鶊F(tuán)標(biāo)記和淬滅功能納米材料的熒光適配體傳感器原理如圖1所示，在適配體的一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，加入具有熒光猝滅能力的納米材料如氧化石墨烯、碳納米管等能夠淬滅其熒光;而當(dāng)有目標(biāo)物存在時(shí)，其與適配體相結(jié)合，導(dǎo)致適配體與納米材料的距離發(fā)生改變，從而阻止FRET過程，引起熒光恢復(fù)。TAN等設(shè)計(jì)一種基于氧化石墨烯(grapheneoxide，GO)水凝膠的標(biāo)記型熒光傳感器檢測土霉素。腺苷和適配體作為交聯(lián)劑以連接GO片，形成三維宏觀結(jié)構(gòu)。適配體與目標(biāo)物結(jié)合后改變標(biāo)記在適配體上的FAM和GO片之間的距離，導(dǎo)致熒光恢復(fù)。在最佳條件下，土霉素的線性響應(yīng)范圍為25～1000μg/L，定量限為25μg/L。

在實(shí)際應(yīng)用中，熒光染料存在抗光漂白性差、熒光性能易受外界因素影響等缺點(diǎn)，因此一些性能更為優(yōu)異的熒光納米材料被應(yīng)用于熒光傳感器的構(gòu)建。OUYANG等[23]開發(fā)了一種基于稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)的適配體傳感器檢測食品中四環(huán)素，連接適配體的磁性納米顆粒(aptamer-magnetic nanoparticles，aptamer-MNPs)和連接互補(bǔ)序列的UCNPs(c DNA-UCNPs)分別用作捕獲探針和信號探針。加入四環(huán)素后，適配體優(yōu)先與四環(huán)素結(jié)合并引起一些c DNA-UCNPs的釋放，導(dǎo)致磁性納米顆粒表面上的熒光信號降低。在最佳條件下，四環(huán)素的檢測線性范圍為0.01～100 ng/m L，檢出限(limit of detection，LOD)為0.0062 ng/m L。

標(biāo)記型適配體傳感器往往需要復(fù)雜的共價(jià)修飾或化學(xué)標(biāo)記，與非標(biāo)記型適配體傳感器相比成本更高，批間差異更大，并且適配體的親和性與選擇性可能受到影響。近幾年，越來越多的非標(biāo)記型核酸適配體傳感器被建立，其主要利用DNA插入型染料、堿基位點(diǎn)結(jié)合染料、金屬納米材料等。由于四環(huán)素適配體及土霉素適配體為G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，所以基于圖2的原理被設(shè)計(jì)應(yīng)用，當(dāng)沒有目標(biāo)物時(shí)，對G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)敏感的熒光探針的熒光強(qiáng)度較高，加入目標(biāo)物導(dǎo)致G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)被破壞，體系熒光降低。SUN等建立一種基于熒光探針噻唑橙(thiazole orange，TO)的非標(biāo)記適配體傳感器用于檢測四環(huán)素。TO是一種插入型熒光染料，在水溶液中基本無熒光，插入具有G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的四環(huán)素適配體時(shí)，熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，適配體與目標(biāo)物的特異性結(jié)合，導(dǎo)致G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)被破壞，TO被釋放出來，熒光強(qiáng)度顯著降低。在最佳條件下，其線性檢測范圍為0.05～100μg/m L，LOD低至0.029μg/m L。用該方法測定加標(biāo)樣品牛奶中的四環(huán)素時(shí)，回收率為90.0%～108.0%，與高效液相色譜法所得結(jié)果基本一致，證實(shí)了該方法的可靠性和準(zhǔn)確性。非標(biāo)記型的熒光適配體傳感器設(shè)計(jì)獨(dú)特，需要了解適配體的二級結(jié)構(gòu)及其與目標(biāo)物的結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用的普遍性收到限制。

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