2.2.6方法學(xué)考察

2.2.6.1線性回歸方程和線性范圍

空白血清稀釋混合對照品溶液(各標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為0.25g/L)，藥物濃度為0.25、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005g/L，取上述系列混合對照品血清溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)處理后進(jìn)行HPLC檢測并記錄色譜圖和峰面積。以橫坐標(biāo)(X)代表血清中藥物的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)(Y)代表藥物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，計(jì)算4種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.2.6.2日間精密度和日內(nèi)精密度試驗(yàn)

大鼠空白血清18份各100μL，不同質(zhì)量濃度的對照品溶液加入后在線性范圍內(nèi)配成低(0.0005g/L)、中(0.005g/L)、高(0.25g/L)3種待測液各6份，按照標(biāo)準(zhǔn)處理后進(jìn)行HPLC檢測并記錄色譜圖和峰面積。每天3個(gè)劑量各測定6次，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度;1周內(nèi)連續(xù)檢測6d，計(jì)算日間精密度。

2.2.6.3方法回收率試驗(yàn)

分別配制6份低、中、高濃度的血清樣本，按照標(biāo)準(zhǔn)處理后進(jìn)行HPLC檢測并記錄色譜圖和峰面積，對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值計(jì)算后測定質(zhì)量濃度。將各成分理論的加入濃度和測定質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，計(jì)算方法回收率。

2.2.6.4基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)

分別配制6份低、中、高質(zhì)量濃度的血清樣本，按照標(biāo)準(zhǔn)處理后進(jìn)行HPLC檢測并記錄色譜圖和峰面積;同時(shí)配制相同濃度的以流動相為基質(zhì)的對照品溶液直接進(jìn)樣分析，空白血清加對照品的測定值與對照品溶液測定值之比即為基質(zhì)效應(yīng)，考察血漿基質(zhì)干擾情況。

2.2.6.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別配制18份低、中、高質(zhì)量濃度的血清樣本，取3種質(zhì)量濃度樣品各6份，在室溫下放置4h，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法處理得到待測血清樣本，每個(gè)質(zhì)量濃度的血清樣本處理完成后進(jìn)行HPLC檢測;取三種質(zhì)量濃度的樣本各6份，－20℃條件下將含藥血漿樣本冷凍24h，室溫下再溶解，反復(fù)凍融3次后進(jìn)行HPLC檢測;另將于－80℃條件將3種質(zhì)量濃度的樣本各5份放置1周，待室溫溶解后進(jìn)行HPLC檢測。計(jì)算3種條件下的標(biāo)準(zhǔn)偏差(ＲSD)，考察穩(wěn)定性。

2.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析(One－wayANOVA)中的LSD法(最小顯著性法)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.8結(jié)果與分析

2.2.8.1專屬性試驗(yàn)

結(jié)果如圖1所示，按照標(biāo)準(zhǔn)處理的大鼠空白血清進(jìn)行HPLC檢測后，空白血清中的香草酸、對羥基苯甲酸、蘆丁及阿魏酸對照品及內(nèi)標(biāo)物與內(nèi)源性物質(zhì)的分離度良好，且沒有干擾物質(zhì)，各藥品及代謝物與內(nèi)源性物質(zhì)之間沒有相互作用，顯示該方法專屬性良好。

2.2.8.2線性回歸方程和線性范圍

血清中對羥基苯甲酸的回歸方程為Y=56971.00X+282.99(Ｒ2=0.9998)，在質(zhì)量濃度0.0005～0.25g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;香草酸的回歸方程為Y=36756.00X+247.66(Ｒ2=0.9997)，在質(zhì)量濃度0.0005～0.25g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;阿魏酸的回歸方程為Y=50686.00X+89.41(Ｒ2=0.9998)，在質(zhì)量濃度0.0005～0.25g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;蘆丁的回歸方程為Y=36349.00X+20.99(Ｒ2=0.9997)，在質(zhì)量濃度0.0005～0.25g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按信噪比(S/N)為3來計(jì)算，對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁的最低檢測限均為是0.0001g/L。

2.2.8.3回收率、精密度、穩(wěn)定性和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

計(jì)算得到各組含藥血漿樣本的方法回收率＞90%，精密度ＲSD＜10%，各組樣品穩(wěn)定性均ＲSD＜10%，基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果在89.53%～95.12%;結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)精密度良好，穩(wěn)定性及回收率均符合藥動學(xué)的要求。

2.2.9基于血清藥物化學(xué)研究不同產(chǎn)地三棱的血中成分測定

根據(jù)HPLC條件，對中藥三棱干預(yù)后的大鼠血漿樣品進(jìn)行測定。以給藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，以相對峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算各成分的含量，結(jié)果顯示在連續(xù)給予大鼠中藥三棱7d后，于末次給藥1h后，三棱的藥效物質(zhì)對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁達(dá)到峰值。具體結(jié)果見表2。

3討論

通過對三個(gè)不同產(chǎn)地三棱藥材中的化學(xué)成分分析及入血成分研究，進(jìn)行色譜比較，確定原型成分及代謝產(chǎn)物為對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁。同時(shí)可見不同產(chǎn)地三棱藥材四種成分體外和入血含量各不相同。藥材提取物中對羥基苯甲酸、阿魏酸、香草酸以浙江產(chǎn)地較高，蘆丁以江蘇產(chǎn)地略高;入血成分中蘆丁、對羥基苯甲酸以安徽產(chǎn)地較高，阿魏酸、香草酸以江蘇產(chǎn)地略高。所有成分均在1h左右達(dá)到峰值。

由于各地栽培的土壤、氣候等差異，藥材提取物中有效成分含量不同，而吸收入血的成分含量也有所不同。入血成分直接決定藥效，所以給藥后取含藥血清進(jìn)行分析，分析鑒定血清中移行成分，研究其藥效相關(guān)性，對確定中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尤為關(guān)鍵，可為建立合理的中藥質(zhì)量控制模式和方法提供參考。本研究可為三棱的資源綜合利用和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國中醫(yī)藥科技》2020年7月第27卷第4期，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

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