目的:比較不同產(chǎn)地的三棱飲片入血成分對(duì)香草酸、羥基苯甲酸、蘆丁及阿魏酸含量的影響。方法:采用高效液相色譜法，對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地的三棱藥材4種有效成分及其在血清中的含量進(jìn)行考察。結(jié)果:由于各地栽培的土壤、氣候等差異，不同產(chǎn)地三棱藥材4種成分體外和入血含量各不相同;藥材提取物中對(duì)羥基苯甲酸、蘆丁以安徽產(chǎn)地較高，香草酸以江蘇產(chǎn)地略高;入血成分中對(duì)羥基苯甲酸、蘆丁以安徽產(chǎn)地較高，阿魏酸、香草酸以江蘇產(chǎn)地略高，所有成分均在1 h左右達(dá)到峰值。結(jié)論:入血成分含量測(cè)定對(duì)三棱藥材的產(chǎn)地鑒別具有一定的可行性，本研究可為三棱的資源綜合利用和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

三棱指的是黑三棱科植物黑三棱的干燥塊莖，其分布范圍主要包括長(zhǎng)江中下游流域，浙江、江蘇、安徽等地。三棱味辛、苦，歸脾經(jīng)、肝經(jīng)，性平，具有消積止痛以及破血行氣等功效，主要用于癥瘕痞塊，痛經(jīng)，瘀血經(jīng)閉，胸痹心痛，食積脹痛等。其主要成分為揮發(fā)油類、黃酮類、皂苷類、生物堿類、苯丙素類及有機(jī)酸類等。三棱具有擴(kuò)血管、抗血栓形成、抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛等作用。此外，三棱對(duì)人肺癌細(xì)胞及人乳腺癌細(xì)胞具有明確的細(xì)胞毒理作用，對(duì)肝癌細(xì)胞株具有明顯的抑制作用。

本研究旨在對(duì)浙江、江蘇、安徽三個(gè)產(chǎn)地三棱藥材中的化學(xué)成分以及血中移行成分含量進(jìn)行比較分析，為三棱的資源綜合利用和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材

三棱藥材購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，浙江(批號(hào):20171016)、江蘇(批號(hào):20170925)、安徽(批號(hào):20170812)，與2015版《中國(guó)藥典》一部的規(guī)定相符合。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，40只，♂，體質(zhì)量(280±20)g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證SCXK(滬)2013－0016。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境:濕度40%～60%，溫度25～27℃，食物充足，照明適度，飲水自由。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，阿魏酸對(duì)照品(純度:≥98%、批號(hào):110773－20161)、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品(純度:≥99%、批號(hào):MKBK3576V)、蘆丁對(duì)照品(純度:≥98%、批號(hào):Y23M7N11586)、香草酸對(duì)照品(純度:98%、批號(hào):110776－20150)、內(nèi)標(biāo)物核黃素(批號(hào):JS0925ＲA14)。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀器:美國(guó)Agilnent;Agilnent Eclipse XDB－C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);QL－861渦旋混合儀:海門市其林貝爾儀器制造;XS205DU精密天平:METTLEＲTOLEDO公司;2－16PK離心機(jī):德國(guó)Sigma公司;ND100－1氮?dú)獯祾邇x:杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司;SK5210HP超聲波清洗儀:上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1不同產(chǎn)地三棱藥材中化學(xué)成分分析

2.1.1溶液的配制

2.1.1.1對(duì)照品溶液的配制

精密稱取適量的對(duì)香草酸對(duì)照品、羥基苯甲酸對(duì)照品、蘆丁、阿魏酸對(duì)照品，溶解于比例為1:1的甲醇水溶液，混標(biāo)儲(chǔ)備液的對(duì)照品濃度為1 g/L，配好備用。

2.1.1.2供試品溶液的配制

分別收集浙江、江蘇、安徽三個(gè)產(chǎn)地的三棱炮制品，取適量樣品粉末及適量甲醇加熱回流，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，過(guò)膜即可。

2.1.2色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18(250 mm×4.6 mm，5μm);0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相A，甲醇為B，采用梯度程序進(jìn)行洗脫:0～5 min，20%B，5～20 min，20～48%B，20～40 min，48～90%B，40～50 min，90%B，50～51 min，90～20%B，51～60 min，20%B。254 nm的檢測(cè)波長(zhǎng);1.00 mL/min的流速;柱溫保持30℃;進(jìn)樣量均為10μL。

2.1.3方法學(xué)考察

2.1.3.1線性關(guān)系考察

將精密稱取的對(duì)照品溶液(0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、6.25 mL)分別置于25 mL的容量瓶中，加50%甲醇至刻度，分別用移液器精密吸取10μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。按流動(dòng)相色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積，以橫坐標(biāo)(X)代表質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)(Y)代表峰面積，利用XY值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)羥基苯甲酸的回歸方程為Y=3.0722X－5.5952(Ｒ2=0.9997)，在質(zhì)量濃度12.5～400 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;香草酸的回歸方程為Y=2.6874X－5.9319(Ｒ2=0.9991)，在質(zhì)量濃度7.5～250 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;阿魏酸的回歸方程為Y=3.0578X－3.7665(Ｒ2=0.9995)，在質(zhì)量濃度7.5～240 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;蘆丁的回歸方程為Y=3.4586X－4.8854(Ｒ2=0.9998)，在質(zhì)量濃度12.5～400 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3.2精密度試驗(yàn)

按照色譜條件，取10μL同一對(duì)照品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，以對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁峰面積計(jì)算。結(jié)果ＲSD為0.24%、0.35%、1.05%、0.64%(n=6)，儀器精密度表現(xiàn)良好。

2.1.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取三棱樣品溶液10μL，按照HPLC色譜條件，分別于2、4、8、12、16、24 h進(jìn)行上樣檢測(cè)并記錄峰面積。對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁峰ＲSD分別為2.76%、2.48%、1.89%、1.68%(n=6)，結(jié)果顯示該樣品溶液在24 h的穩(wěn)定性良好。

2.1.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份三棱樣品，每份2 g，供試品溶液按照標(biāo)準(zhǔn)制備后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁峰的ＲSD分別為1.68%、1.54%、2.45%、2.14%(n=6)。

2.1.3.5加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取已知含量的三棱樣品9份，加入對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，供試品溶液按照標(biāo)準(zhǔn)制備后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算回收率，對(duì)羥基苯甲酸的平均回收率為98.42%，ＲSD為1.79%(n=9);香草酸的平均回收率為97.35%，ＲSD為0.85%(n=9);阿魏酸平均回收率為99.12%，ＲSD為1.59%(n=9);蘆丁平均回收率為100.56%，ＲSD為1.89%(n=9)。

2.1.4不同產(chǎn)地三棱藥材含量測(cè)定

取3個(gè)產(chǎn)地的三棱樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)制成供試品溶液。分別吸取供試品溶液10μL，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，根據(jù)相應(yīng)線性關(guān)系計(jì)算樣品中對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2不同產(chǎn)地三棱入血成分研究

2.2.1不同產(chǎn)地三棱藥材提取

采用傳統(tǒng)煎煮法，取3個(gè)產(chǎn)地三棱中藥制成含生藥2 g/mL的三棱水煎液原液。

2.2.2含藥血清制備

取SD大鼠40只，♂，體質(zhì)量(280±20)g，飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分4組，每組10只，空白對(duì)照組、浙江組、江蘇組、安徽組。每組分別給予相應(yīng)的不同產(chǎn)地的三棱藥材提取液，空白對(duì)照組每天給予等量飲用水，每日固定時(shí)間灌胃。大鼠的常規(guī)給藥劑量按照(藥液濃度2 g生藥/mL，劑量2 mL/100 g)計(jì)算，灌胃1次/d，連續(xù)灌胃7 d。最后一次給藥前禁食12 h，末次給藥結(jié)束后，分別于0.5、1、1.5、2、4 h進(jìn)行大鼠眼眶靜脈叢取血，3 000 r/m離心10 min，收集上層血清，56℃滅活30 min，取出后無(wú)菌過(guò)濾，放入－20℃冰箱保存。每組做混標(biāo)，混合成2管血清組。

2.2.3對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)的配制

精密稱取對(duì)香草酸對(duì)照品、羥基苯甲酸對(duì)照品、蘆丁及阿魏酸對(duì)照品適量，溶解于甲醇水溶液(1∶1)，混標(biāo)儲(chǔ)備液的對(duì)照品濃度為1 g/L，充分混勻，超聲30 min，用0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，保存在4℃，檢測(cè)前稀釋成不同濃度。精密稱取內(nèi)標(biāo)物核黃素適量，溶解于甲醇水溶液(1∶1)，配制內(nèi)標(biāo)物濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液，渦旋充分混勻，超聲30 min，用0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，保存在4℃。

2.2.4樣本處理

300μL甲醇和100μL內(nèi)標(biāo)溶液加到200μL血清樣本中，利用渦旋儀進(jìn)行震蕩10 s，此時(shí)的溶液為乳白色懸濁液，12 000 r/min、4℃下離心12 min，蛋白質(zhì)為底部白色沉淀。全部上清用移液槍吸出至離心管后進(jìn)行氮吹，100μL甲醇水溶液(1∶1)復(fù)溶殘?jiān)?，渦旋混勻，常溫下12 000r/min離心10 min，取上清用于測(cè)定。

2.2.5色譜條件同2.1.2色譜條件。

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