我國(guó)是全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家，養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量逐年增長(zhǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019 年我國(guó)養(yǎng)殖水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá) 6 450 萬(wàn) t，超過(guò)世界養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量的 70%，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的供給以及國(guó)家的糧食安全做出了巨大貢獻(xiàn)。目前，高密度、集約化已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要模式，然而，養(yǎng)殖密度的不斷提高極易打破池塘原有的生態(tài)平衡，過(guò)多的殘餌、糞便無(wú)法被池塘中的微生物分解利用，導(dǎo)致氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)積累，影響?zhàn)B殖動(dòng)物健康。此外，不經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水排放到外環(huán)境中產(chǎn)生面源污染，危害養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。生物脫氮不僅安全環(huán)保，而且具有可續(xù)持性，近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌因其能夠在有氧的條件下進(jìn)行 反 硝 化 作 用，脫 氮 徹 底，而且具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快及容易控制等潛在優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為脫氮益生菌中研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。

在益生菌研究和應(yīng)用中，菌種篩選是一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)。然而，由于在菌種篩選過(guò)程中候選菌株眾多而且篩選條件各異，水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的益生菌菌種篩選的方法、標(biāo)準(zhǔn)非常繁雜，導(dǎo)致菌種篩選效率低下; 次，實(shí)驗(yàn)室篩選得到的菌種在養(yǎng)殖試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)程中，其功能往往不能較好的重現(xiàn)，這主要是由于實(shí)驗(yàn)室篩選益生菌的條件或許同其應(yīng)用的環(huán)境有所區(qū)別，從而使益生菌應(yīng)用后在靶位點(diǎn)難以生長(zhǎng)、定植及發(fā)揮功能; 此外，某些對(duì)哺乳動(dòng)物有益的微生物應(yīng)用于水生動(dòng)物可能會(huì)產(chǎn)生不利影響。因此，在益生菌菌種篩選過(guò)程中制定適合水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法、標(biāo)準(zhǔn)就顯得非常重要。目前，已有很多關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中好氧反硝化菌種篩選應(yīng)用的研究］，但尚未見(jiàn)到對(duì)該菌種篩選及評(píng)價(jià)方法進(jìn)行系統(tǒng)綜述的報(bào)道。因此，本文對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中好氧反硝化細(xì)菌的篩選、評(píng)價(jià)方法進(jìn)行歸納、總結(jié)，以期對(duì)好氧反硝化細(xì)菌篩選和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 提 供 參 考，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。

1 菌種篩選流程

隨著研究的深入，已有大量好氧反硝化細(xì)菌的研究 報(bào) 道，主 要 菌 種 包 括: 假 單 胞 (Pseudomonas sp．)、芽孢桿菌( Bacillus sp．) 、副球菌 Paracoccus sp．) 、海 桿 菌(Marinobacter sp．)、鹽 單 胞 菌 ( Halomonas sp．)  和 紅 球 菌( hodococcus sp．) 等，然而，尚缺乏對(duì)該菌種篩選和評(píng)價(jià)的系統(tǒng)報(bào)道。通過(guò)歸納、總結(jié)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，好氧反硝化菌種篩選流程和標(biāo)準(zhǔn)如圖 1所示。具體而言，好氧反硝化細(xì)菌的篩選包括了樣品采集、富集培養(yǎng)、安全性評(píng)估、菌種鑒定、耐受性評(píng)估、功能性評(píng)估及應(yīng)用試驗(yàn)評(píng)估等主要組成步驟。通過(guò)層層篩選，獲得的菌種需要符合安全性、適應(yīng)性、功能性和便利性等特點(diǎn).

2 樣品處理

理想的益生菌，應(yīng)該能夠在宿主的腸道或環(huán)境中定殖、建立和繁殖，然而，某些應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)的益生菌常出現(xiàn)相對(duì)無(wú)效的情況，這或許是由于非魚類來(lái)源的益生菌無(wú)法在其腸道中生存或保持最佳的活菌數(shù)。基于此，好氧反硝化菌種分離常采集的樣本最好選取池塘的水樣、沉積物、微生物絮團(tuán)及水產(chǎn)動(dòng)物腸道等樣本，從這些樣本中篩得的菌種具有更好的適應(yīng)性，即原位 /宿主益 菌 策 略autochthonousprobiotics/hostassociated probiotic) 。以往研究也發(fā)現(xiàn)，在水、泥、沉積物及生物絮團(tuán)樣品中更易篩得好氧反硝化細(xì)菌，如濱海芽孢桿菌( Bacillus litoralis) 、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis) 、施氏假單胞菌( Pseudomonas stutzeri)  及 Paracoccus saliphilus 等 菌 種，且具有較好的適應(yīng)性。此外，采集的樣本還可以用高濃度的硝酸鹽、亞硝酸鹽及銨鹽作為唯一氮源進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中需要進(jìn)行間歇曝氣以達(dá)到好氧反硝化微生物數(shù)量增加，同時(shí)確保目的菌種的好氧反硝化性能不退化或可得到進(jìn)一步加強(qiáng)，通過(guò)富集培養(yǎng)可大幅度提高后續(xù)菌種的篩選效率。

3 菌種初篩

好氧反硝化菌株初步篩選可應(yīng)用溴百里酚藍(lán)( bromothymol blue，BTB) 固體培養(yǎng)基，接種的細(xì)菌由于反硝化作用使 pH 升高，從而產(chǎn)生藍(lán)色暈圈，選取藍(lán)色菌落即可實(shí)現(xiàn)菌種的初篩。應(yīng)用該方法，從循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池中分離到好氧條件下能脫氮的菌株 Z1 和 Z8，Song 等］分離篩選得到高效脫氮的好氧反硝化菌株凝結(jié)芽孢桿菌( Bacillus coagulans) XY-6，也篩選 得 到 脫 氮 性 能 較 好 的 好 氧 反 硝 化 菌 種Pseudomonas sp． B5。根據(jù)篩選流程，初篩獲得的菌種還需要進(jìn)行安全性評(píng)估、菌種鑒定及耐受性評(píng)價(jià)。

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