2.4　菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

試驗結(jié)果如圖3，當(dāng)菌齡低于4天，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也會增加，當(dāng)菌齡高于4天時，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的再生率逐步降低；當(dāng)菌齡大于6天時，原生質(zhì)體再生率急速下降。經(jīng)過回歸方程計算可以得出：原生質(zhì)體再生率在5.4天時達(dá)到最高，約為2.07%；原生質(zhì)體的產(chǎn)量在4.1天時達(dá)到頂點，為2.01×108個/毫升。

2.5　穩(wěn)滲劑種類對原生質(zhì)體制備產(chǎn)量與再生率的影響

圖4可以看出，當(dāng)選取甘露醇作為滲穩(wěn)劑時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高但是再生率很低，當(dāng)使用硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量排名第三，僅處于甘露醇和葡萄糖作為滲穩(wěn)劑之后；硫酸鎂的再生率為1.73%，葡萄糖的再生率為1.60%，此再生率僅次于用蔗糖當(dāng)作穩(wěn)滲劑的再生平板，蔗糖的再生率為1.94%。由于在制備原生質(zhì)體時，使用硫酸鎂當(dāng)作穩(wěn)滲劑，不但能夠較好的維持菌絲體細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定性，同時滲穩(wěn)劑中的Mg2+也能夠通過交聯(lián)羧基和磷脂質(zhì)實現(xiàn)維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的作用。但是Mg2+的供能能力較差，難以維持細(xì)胞壁再生所需要的能量，同理單糖也無法實現(xiàn)此項需求。因此，想要實現(xiàn)原生質(zhì)體再生率最大化，應(yīng)該選用硫酸鎂作為制備滲穩(wěn)劑，蔗糖作為再生滲穩(wěn)劑。

2.6　穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖5可以看出，滲穩(wěn)劑濃度對于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都能產(chǎn)生影響，當(dāng)使用純凈水作為參照時，目標(biāo)菌絲的原生質(zhì)體產(chǎn)量是4.2×107個/毫升，原生質(zhì)體的再生率為0。在此基礎(chǔ)上不斷加大滲穩(wěn)劑的濃度，可以看出原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率均呈現(xiàn)先增大后減小的變化。通過觀察試驗曲線可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度低于0.2摩爾/升時，隨著度增加，原生質(zhì)體再生率提升明顯，此后隨著濃度增加原生質(zhì)體再生率無明顯變化；經(jīng)過回歸方程計算：當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度為0.51摩爾/升時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高1.85×108個/毫升，當(dāng)穩(wěn)滲劑的濃度為0.33摩爾/升的時候，原生質(zhì)體的再生率會達(dá)到最大值1.97%。

2.7 pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

通過觀察下圖6，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)滲穩(wěn)劑pH處于3～4時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量基本上是穩(wěn)定沒有變化，原生質(zhì)體的再生率為0；當(dāng)處于4～5時，對于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都有顯著的提升刺激；當(dāng)處于5～7時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量與再生率都會出現(xiàn)不同程度的下降，回歸分析后得出，當(dāng)pH為5.10時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)到最大值，為2.34×108個/毫升，當(dāng)pH為5.69時，原生質(zhì)體的再生率可達(dá)到最大值，為1.86%。

3 小結(jié)與討論

供給試驗使用的幾種因素在固定限度之中時，都能夠提升原生質(zhì)體的產(chǎn)量以及再生率，并且具有明顯的效果。原生質(zhì)體的最佳制備條件為，在pH為5.0的條件下，使用0.5摩爾/升硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑，在溫度達(dá)到28℃的時候?qū)?日齡菌絲進行酶解3小時。最佳再生條件為，在pH為5.5的條件下，使用0.5摩爾/升蔗糖作為穩(wěn)滲劑，在溫度達(dá)到27.8℃的時候?qū)?.5日齡菌絲進行酶解2.9小時。

酶活和酶解的反應(yīng)時間將會決定原生質(zhì)體的產(chǎn)量大小，各種因素對原生質(zhì)體的產(chǎn)量所造成的影響效果由小到大依次為，滲穩(wěn)劑、齡、菌酶解時間、酶解溫度。同時，酶活性受到酶解液pH和酶解溫度的影響，進而影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。當(dāng)pH為4.5～6.0范圍內(nèi)，則45～55℃為纖維素酶的最適宜溫度，30～37℃為蝸牛酶的最適宜溫度，酶促反應(yīng)的快慢與酶活性成正相關(guān)關(guān)系；同時混合酶的酶解效果要比單一酶效果顯著；在單位時間內(nèi)，混合酶產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量要大于單一酶所產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量。

原生質(zhì)體活性的大小可直接決定原生質(zhì)體再生率的大小，本次研究中選取的各項因素對于原生質(zhì)體再生率影響效果由小到大分別是，酶解溫度、菌齡、酶解時間、滲穩(wěn)劑濃度。滲穩(wěn)劑的濃度過大會導(dǎo)致原生質(zhì)體失水失活、滲穩(wěn)劑濃度過小會導(dǎo)致原生質(zhì)體脹破，這都會影響原生質(zhì)體的再生率。當(dāng)反應(yīng)酶處于其適宜反應(yīng)條件時，酶解的反應(yīng)比較快速，因為混合酶系能夠?qū)Ω鞣N各樣的底物進行酶解反應(yīng)，但是，隨著酶解時間不斷增加，原生質(zhì)體膜暴露時間過長會導(dǎo)致其細(xì)胞壁再生下降。因此，原生再生率也將會減弱。溫度為（25±1）℃時，是香菇菌絲和原生質(zhì)體的最佳生長溫度，過高或者過低均會影響再生率。

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