1.2.4.4 重復(fù)性試驗

吸取6份平行羊肚菌樣品供試溶液，進行衍生化處理，按上述的色譜條件進樣測定，記錄17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計算RSD值以考察實驗的重復(fù)性。

1.2.4.5 穩(wěn)定性試驗

取樣品供試溶液，衍生化后，于0、2、4、8、16、24h進樣分析，記錄17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計算RSD值以評價樣品的穩(wěn)定性。

1.2.4.6 加樣回收率試驗

精密稱量已知含量的羊肚菌樣品9份，每份10mg，置于安瓿瓶中，按150%、100%、50%的比例加入標準品，根據(jù)“1.2.2.1”操作后進行衍生化處理，在上述“1.2.3”的色譜條件下測定。根據(jù)測得的氨基酸的量，計算回收率和RSD值。

1.2.5 樣品含量的測定

平行取3份云南羊肚菌樣品溶液，進行衍生化處理，按上述的色譜條件測定。采用一測多評法和內(nèi)標法對羊肚菌中17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的含量進行計算。

1.2.6 耐用性考察

1.2.6.1 不同色譜柱的考察

精確吸取混合標準品溶液，進行衍生化處理后，在Agilent1100高效液相色譜儀，“1.2.3”的色譜條件下考察依利特HypersilODS2（250mm×4.6mm，5μm）和AgilentC₁₈（250mm×4.6mm，5μm）對氨基酸相對校正因子的影響。

1.2.6.2 不同儀器的考察

精密吸取混合對照品溶液，進行衍生化處理后，采用依利特HypersilODS2（250mm×4.6mm，5μm）在“1.2.3”色譜條件下，考察兩臺不同色譜儀Agilent1100HPLC、Agilent1260HPLC對氨基酸相對校正因子的影響。

1.2.6.3 色譜峰定位

精密吸取混合對照品溶液，進行衍生化處理后，采用依利特HypersilODS2（250mm×4.6mm，5μm）、AgilentC18（250mm×4.6mm，5μm），在Agilent1100HPLC、Agilent1260HPLC中測定并計算以Glu為內(nèi)參物，其他氨基酸的相對保留時間。

1.2.7 不同地區(qū)羊肚菌的測定

精密稱量6個不同地區(qū)的羊肚菌，按“1.2.2.1”方法制備樣品供試溶液，進行衍生化處理，按“1.2.3”色譜條件進樣分析，采用一測多評法對氨基酸進行含量計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用IBMSPSSStatistics26.0軟件進行t檢驗，實驗譜圖Originpro9.1處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品、樣品及空白色譜圖

在前期研究中，最初選擇鄰苯二甲醛為柱前衍生試劑，但衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，實驗的重現(xiàn)性較差。在文獻調(diào)研后，選擇了異硫氰酸苯酯為柱前衍生試劑，其反應(yīng)條件溫和、衍生產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，重復(fù)性好。在前期的色譜條件研究中，考察了衍生時間對17種氨基酸出峰面積的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生30min的出峰面積與衍生60min的出峰面積有一定差異，衍生30min時間較短，可能導(dǎo)致衍生不完全，影響含量測定的準確度；衍生90min與衍生60min的出峰面積一致，考慮效率問題，選擇衍生時間為60min。

空白、標準品及樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。由圖1可知，在“1.2.3”色譜條件下，17種氨基酸的峰型良好，干擾較少，分離清晰。

2.2 一測多評方法學(xué)考察

2.2.1 線性考察

精密吸取不同濃度對照品溶液，衍生化處理后注入色譜儀，結(jié)果見表1。由表1可知，17種氨基酸在線性范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R²＞0.9990。詳見表1。

2.2.2 相對校正因子的計算

通過研究發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸在羊肚菌中的含量均較高且較穩(wěn)定。但從質(zhì)控成本角度來看，谷氨酸較其他三種成分價格更加低廉且附近干擾峰較少。根據(jù)QAMS法內(nèi)參物易得、價廉、有效、穩(wěn)定的選擇原則，本研究最終選擇谷氨酸作為內(nèi)參物進行相對校正因子的計算。

以Glu為內(nèi)參物，計算其與其他16種氨基酸的相對校正因子，結(jié)果表明，16種氨基酸的相對校正因子RSD≤1.73%，詳見表2。

2.2.3 精密度試驗

按“1.2.4.3”項下進行試驗，結(jié)果顯示，17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積RSD（n=6）為0.89%、0.46%、1.08%、0.61%、1.17%、0.31%、0.50%、0.80%、0.80%、1.89%、0.45%、0.52%、0.90%、0.53%、0.88%、0.54%、0.57%，RSD均小于2.0%，表示儀器的精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗

按“1.2.4.4”項方法進行測定，結(jié)果顯示，17種氨基酸峰（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）面積的RSD為0.56%、1.72%、1.87%、0.42%、1.53%、1.85%、1.49%、0.80%、0.93%、1.68%、0.60%、1.17%、0.92%、1.48%、0.77%、0.96%、1.65%，RSD均小于2.0%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

按“1.2.4.5”項方法進行測定，結(jié)果顯示，17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）峰面積的RSD為0.63%、1.48%、0.99%、1.37%、1.03%、1.49%、1.02%、1.41%、0.78%、0.67%、1.32%、1.24%、1.38%、0.75%、1.54%、1.24%、0.75%，RSD均小于2.0%，說明樣品供試溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收率試驗

按“1.2.4.6”項下進行試驗，結(jié)果表明，羊肚菌中17種氨基酸的平均回收率在92.42%～101.16%之間，RSD<2.0%，說明氨基酸的回收率較好。詳見表3。

相關(guān)鏈接：蘇氨酸，鄰苯二甲醛，異硫氰酸苯酯，谷氨酸

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