2.2.2 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料對(duì)芽孢率的影響

圖6顯示了枯草芽孢桿菌GX2的芽孢發(fā)酵曲線，同時(shí)給出了活菌數(shù)和芽孢率隨發(fā)酵時(shí)問(wèn)的變化情況?？梢?，隨著發(fā)酵時(shí)問(wèn)的延長(zhǎng)，活菌和芽孢濃度和芽孢率均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，發(fā)酵至10h和11h時(shí)，活菌和芽孢濃度達(dá)最大，分別為1.1×10¹⁰，和7.2×10⁹CFu/mL，此時(shí)，芽孢率也達(dá)最大，為66.6％。此后，活菌數(shù)開始下降，芽孢數(shù)也相應(yīng)降低，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入衰亡期。在這個(gè)基礎(chǔ)上，發(fā)酵至9h時(shí)改變發(fā)酵條件，開展后續(xù)產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化研究。

2.3 發(fā)酵罐產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一種抗逆休眠體，因其具有耐熱、抗輻射、耐酸堿及抗化學(xué)藥物等特殊性質(zhì)，可有效抵抗外界環(huán)境條件的變化，提高存活率，優(yōu)化芽孢形成條件對(duì)微生物菌劑的制備具有一定的實(shí)踐價(jià)值。與菌體的生長(zhǎng)繁殖相似，芽孢的形成同樣受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及環(huán)境條件等多因素的影響，在分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)提高細(xì)胞濃度的基礎(chǔ)上，對(duì)影響枯草芽孢桿菌GX2產(chǎn)芽孢的關(guān)鍵環(huán)境條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高芽孢數(shù)及芽孢率，可為提高好氧堆肥用微生物菌劑的品質(zhì)及其實(shí)際應(yīng)用效果奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌CX2芽孢率的影響

培養(yǎng)溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖和芽孢形成的重要環(huán)境條件之一，它主要通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)生物大分子酶和蛋白質(zhì)的合成與活性來(lái)促進(jìn)芽孢形成。作者在搖瓶實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并采用分批補(bǔ)料技術(shù)，使得細(xì)胞濃度在培養(yǎng)9h時(shí)達(dá)到最大，然后調(diào)整培養(yǎng)溫度，研究溫度對(duì)芽孢桿菌GX2芽孢率的影響，結(jié)果如圖7所示?？梢姡囵B(yǎng)溫度可在一定程度上影響微生物的生長(zhǎng)繁殖及芽孢的形成，隨溫度升高，活菌及芽孢濃度均呈大致增加的趨勢(shì)，而芽孢率先升高后降低。當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，活菌和芽孢濃度均較低，分別為9.2×10⁹、5.5×10⁹CFU/mL，芽孢率為59.8％。此后，隨著培養(yǎng)溫度升高，活菌濃度和芽孢數(shù)逐步提高，50℃時(shí)，芽孢數(shù)和芽孢率均最大，分別為7.55×10，CFU/mL和70.6％。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至55℃時(shí)，盡管活菌數(shù)和芽孢數(shù)略有升高，但芽孢率開始下降，因此，后續(xù)產(chǎn)芽孢研究的培養(yǎng)溫度采用50℃。

2.3.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌GX2芽孢率的影響

好氧堆肥用枯草芽孢桿菌GX2為好氧菌，氧氣是其生長(zhǎng)繁殖和芽孢生成的重要影響因素。同時(shí)，溶解氧對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本也具有較大影響。發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液中的溶解氧與通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速有關(guān)，當(dāng)通氣量一定時(shí)，可通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速改變發(fā)酵液中的溶解氧濃度，進(jìn)而優(yōu)化發(fā)酵及產(chǎn)芽孢過(guò)程。攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌GX2產(chǎn)芽孢的影響如圖8所示?？梢姡S攪拌轉(zhuǎn)速的升高，活菌濃度不斷下降，而芽孢濃度和芽孢率卻呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。由于發(fā)酵液中的細(xì)胞(活菌)濃度較高，約1.2×10¹⁰CFU/mL，較高的攪拌轉(zhuǎn)速帶來(lái)較大的剪切力，不利于細(xì)胞存活，因此，隨攪拌轉(zhuǎn)速升高活菌數(shù)不斷下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時(shí)，隨攪拌轉(zhuǎn)速升高，較高的剪切力使得更多營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為芽孢，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min時(shí)，芽孢濃度和芽孢率均最大，分別為9.7×10⁹CFU/mL和82.9％，進(jìn)一步提高攪拌轉(zhuǎn)速，芽孢率開始下降，這與較高轉(zhuǎn)速下活菌數(shù)較低有關(guān)。

2.3.3 pH對(duì)枯草芽孢桿菌GX2芽孢率的影響

不同微生物菌株適宜的pH條件不同，酸堿度影響微生物細(xì)胞膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及物質(zhì)的溶解性或電離性，致使微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用呈現(xiàn)差異，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，并對(duì)芽孢桿菌的芽孢率產(chǎn)生影響。由圖9可知，隨DH升高，活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)pH為6.8時(shí)，活菌濃度最大，為1.25×10¹⁰CFU/mL。當(dāng)pH升高至7.3時(shí)，盡管活菌數(shù)開始降低，但芽孢濃度和芽孢率達(dá)最大，分別為9.7×10⁹CFU/mL和82.9％。進(jìn)一步升高pH，活菌數(shù)、芽孢濃度以及芽孢率均明顯降低。

2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證

正交試驗(yàn)是考察關(guān)鍵影響因素綜合效應(yīng)及進(jìn)行多條件優(yōu)化的研究方法之一。這里，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和pH為關(guān)鍵影響因素，選用正交表進(jìn)3因素3水平的正交試驗(yàn)研究，以活菌數(shù)和芽孢數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究關(guān)鍵影響因素對(duì)芽孢桿菌GX2產(chǎn)芽孢的綜合效應(yīng)，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示，正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，3個(gè)影響因素對(duì)活菌數(shù)的影響主次順序?yàn)閜H＞攪拌轉(zhuǎn)速＞培養(yǎng)溫度，由均值κ得出最優(yōu)組合為A₂B₂C₂，即pH為7.3，培養(yǎng)溫度為45℃，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min。從芽孢率角度，3個(gè)影響因素的主次順序與活菌數(shù)相似，但其最優(yōu)組合不同，為A₁B₃C₃，即pH為6.8，培養(yǎng)溫度為50℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min。

較高的活菌數(shù)是提高芽孢率的前提，因此，從優(yōu)化菌株生產(chǎn)性能，提高芽孢率的角度，選擇枯草芽孢桿菌GX2的活菌數(shù)和芽孢數(shù)均較高的培養(yǎng)條件和方案，確定最優(yōu)方案為A₁B₃C₃，即pH為6.8，培養(yǎng)溫度為50℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，在此條件下進(jìn)行3L發(fā)酵罐試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，活菌數(shù)可達(dá)1.57×10¹⁰CFU/mL，芽孢數(shù)達(dá)1.32×10¹⁰CFU/mL，芽孢率為84.1％。與單因素優(yōu)化相比，正交試驗(yàn)優(yōu)化可進(jìn)一步提高芽孢桿菌GX2的芽孢率，是其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的重要參考。

3 討論

好氧堆肥過(guò)程中添加微生物菌劑已成為促進(jìn)堆肥腐熟、縮短堆肥周期的重要方法之一。微生物菌劑的作用效果與活菌數(shù)密切相關(guān)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)逐漸減少，影響堆肥效果。芽孢桿菌因其具有較強(qiáng)的抗逆性，能耐熱、酸、堿等不良環(huán)境，有利于微生物菌劑活性的保持，提高產(chǎn)品質(zhì)量及應(yīng)用效果。Huo等通過(guò)研究多粘芽孢桿菌孢子和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在生物有機(jī)肥貯藏過(guò)程中的活性，發(fā)現(xiàn)純孢子可提高儲(chǔ)存期問(wèn)的存活率和孢子形成。優(yōu)化芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢條件，促進(jìn)更多營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為芽孢。

培養(yǎng)條件優(yōu)化是產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化的重要前提。作者以實(shí)驗(yàn)室保存的堆肥用枯草芽孢桿菌GX2為研究對(duì)象，首先進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，采用分批補(bǔ)料策略在3L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液的0D值和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞濃度可達(dá)2.250和1.8×10¹⁰CFU/mL。汪晶晶等通過(guò)對(duì)淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)基及條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)量有明顯提高，A_600nm由1.228增加至1.6727。

目前，關(guān)于芽孢桿菌芽孢率的優(yōu)化研究多是在搖床上完成的，郭曉軍等對(duì)堆肥用產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行了優(yōu)化，芽孢率達(dá)95％。劉虎軍等對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行了DH和溫度的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，生物量和芽孢數(shù)分別為5.7×10¹⁰、5.2×10¹⁰CFU/mL，芽孢率達(dá)91％。為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，發(fā)酵罐規(guī)模的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化更具參考價(jià)值，為此，作者在搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，結(jié)合分批補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)，在3L發(fā)酵罐上進(jìn)行了產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，經(jīng)單因素及正交試驗(yàn)研究，獲得了堆肥用枯草芽孢桿菌CX2的最佳產(chǎn)芽孢條件，即pH為6.8，培養(yǎng)溫度為50℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，此時(shí)，芽孢濃度為1.32×10¹⁰CFU/mL，芽孢率為84.1％，研究結(jié)果可為芽孢桿菌在微生物菌劑中的工業(yè)化應(yīng)用提供重要參考。

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