1.2.4 重組植物過氧化氫酶的構建

以提取的枯草芽孢桿菌S7基因組為模板，根據(jù)飛行質(zhì)譜結果獲得的植物過氧化氫酶基因序列設計引物(見表2)，PCR擴增從而獲取目的基因片段。隨后將載體pET-24a(+)與PCR產(chǎn)物分別與相對應的限制性內(nèi)切酶混合，在37℃下孵育1.5h，兩者酶切產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化后用DNA連接酶連接，在16℃下連接6～8h，連接產(chǎn)物通過熱激法轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在LB卡那霉素抗性平板上挑取陽性克隆子，菌落PCR驗證后提取質(zhì)粒，經(jīng)過測序鑒定，最終獲得含有目的基因的重組質(zhì)粒pET-24a(+)/katA。將質(zhì)粒pET-24a(+)/katA轉化E.ColiBL21(DE3)感受態(tài)細胞，最終獲得重組植物過氧化氫酶表達菌株。

1.2.5 重組蛋白的純化

純化過程全部在4℃下進行，將離心收集的重組菌充分倒入培養(yǎng)基。將菌體重懸于25mL緩沖液A(200mmol/LTris-HCl(pH7.4)，500mmol/LNaCl，5mmol/Lβ-mercaptoe-than01)中，使用BransonSonmer450對細胞進行了超聲破壁處理，高速離心后收集破碎液上清液。再采用AKTAStart(GEHealthcare)和HisTraD親和柱對目標蛋白質(zhì)進行純化，在經(jīng)緩沖液A平衡后接入上清液，先使用含5mmol/L咪唑的緩沖液A進行清洗后，使用含300mmol/L咪唑的緩沖液A進行洗脫，獲得重組植物過氧化氫酶。

1.2.6 脫脂奶粉水解產(chǎn)物的LC-MS/MS活性多肽鑒定

水解產(chǎn)物經(jīng)過超濾、脫鹽等預處理后，直接加載到反相預柱(AcclaimPepMapRSLC)進行肽段分離，分離后肽段經(jīng)QExactiveP1us混合四極軌道質(zhì)譜儀分析，收集的串聯(lián)質(zhì)譜結果上傳至mascot搜索引擎進行分析，比對后獲得對應的肽段序列。

2 結果與分析

2.1 針對底物α_s1酪蛋白高選擇性的野生菌篩選與鑒定

將篩選獲得的野生菌進行16SrRNA和功能基因gyrA鑒定，以確定各個野生菌的種屬，再分別進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得其發(fā)酵液上清液。由于不同野生菌蛋白酶表達量不同，無法直接使用發(fā)酵液上清液進行橫向比較。而0PA法可檢測整個體系水解程度，ELISA可以檢測水解反應體系中針對某一特定底物的水解程度，利用此特點設計實驗，首先通過0PA法確定各個發(fā)酵液的酶活，再分別稀釋，使其針對整體底物脫脂奶粉的酶活達到相同水平。此后，將調(diào)整濃度后的發(fā)酵液對脫脂奶粉進行水解反應，并通過ELISA分析對底物α_s1酪蛋白的酶活。如此可篩選出對混合底物脫脂奶粉的酶活相同時，對過敏原α_s1酪蛋白選擇性更高的蛋白酶產(chǎn)生菌。如圖2所示，橫坐標為各個野生菌的種屬名和篩選編號，縱坐標為調(diào)整后發(fā)酵液上清液的水解叱，酪蛋白酶活。其中酶活最高的為枯草芽孢桿菌S7發(fā)酵液上清液，而作為對照的商業(yè)酶A-2SD和NY-10酶活較低。在總酶活調(diào)整一致的情況下，其他野生菌針對過敏原酶活水平不高，如嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌S2、綠膿假單胞菌S8(非食品安全菌)，故選擇枯草芽孢桿菌S7為去除過敏原的主要研究對象，并進行菌種保藏(CCTCCN0.M2016532)。同時被鑒定為枯草芽孢桿菌的還有S21和S23，值得關注的是S21和S23酶活水平接近，但與S7有顯著差異。

2.2 關鍵酶鑒定

通過比對S7和S21的發(fā)酵液上清液進行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌S7在5.5×10⁴位置分泌的一種蛋白質(zhì)在S21發(fā)酵液中分泌量極少。此后使用MALDI-TOF/T0F對各個條帶進行肽指紋圖譜分析，如圖3所示，以3.2×10⁴的鞭毛蛋白(uniProtKB：P02968，含量最高條帶)作為對比參照，主要蛋白酶為2.8×10⁴的枯草芽孢桿菌蛋白酶E(UniProtKB：P04189)，而表達量差異最大是5.5×10⁴的植物過氧化氫酶(UniProtKB：P26901)。

2.3 植物過氧化氫酶的重組表達及功能驗證

通過從枯草芽孢桿菌S7中調(diào)取植物過氧化氫酶基因，并構建重組表達質(zhì)粒，獲得異源表達菌株。再通過誘導表達和鎳柱親和層析法，獲得了重組植物過氧化氫酶。如圖4中SDS-PAGE所示，泳道1為鎳柱純化流穿峰，泳道2為5mmol/L咪唑洗脫峰，泳道3為300mmol/L咪唑洗脫峰，在5.5×10⁴左右可見明顯條帶，證明獲得可融性表達的重組酶。

通過將純化后的重組植物過氧化氫酶回補至S21發(fā)酵液上清液巾，S21水解α_s1酪蛋白的酶活從75.43U/L提升至106.18U/L達到與S7的119.43U/L相近水平，從而證明了S7和S21的酶活差異主要是由植物過氧化氫酶的表達量差異導致的。據(jù)此，我們發(fā)現(xiàn)植物過氧化氫酶不僅可以水解過氧化氫，維持更好的還原環(huán)境，協(xié)助枯草芽孢桿菌蛋白酶E抵抗氧化應激，保護其結構不被自由基破壞，增加蛋白酶作用時間；可能還具有破壞蛋白膠粒中的二硫鍵，將其中的過敏原α_s1酪蛋白釋放出來，使蛋白酶可以更高效地進行水解反應，增強蛋白酶的選擇性脫敏效果(見圖5)。

聲明：本文所用圖片、文字來源《食品與生物科技》，版權歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關鏈接：枯草芽孢桿菌，過氧化氫，過氧化氫酶，蛋白酶