好氧堆肥化是有機固體廢棄物減量化、無害化及資源化的有效途徑之一，是在微生物作用下通過高溫發(fā)酵使有機物變成腐熟肥料的過程。好氧堆肥不僅含有大量可被植物吸收利用的有效態(tài)氮、磷、鉀及其化合物，而且含有構(gòu)成土壤肥力的重要活性物質(zhì)腐殖質(zhì)，既解決了有機同體廢棄物的環(huán)境污染問題，又起到改良土壤和增加肥效的作用。在好氧堆肥過程中添加外源微生物菌劑可有效提高堆體中功能微生物的數(shù)量，加快有機物轉(zhuǎn)化及堆肥進程，提高肥效。Xi等通過接種復(fù)合菌劑增加堆肥過程中細菌的多樣性，可有效提高堆肥效率。Zhao等發(fā)現(xiàn)在堆肥過程中接種放線菌可顯著提高纖維素酶活性，加速纖維素降解，提高腐殖質(zhì)含量，減少溫室氣體排放。微生物菌劑的應(yīng)用效果與活菌數(shù)密切相關(guān)，有效活菌數(shù)是衡量微生物菌劑品質(zhì)的重要指標(biāo)，然而，隨著微生物菌劑保存時間的延長，活菌數(shù)不斷減少，降低菌劑的使用效果，同時，微生物菌劑的制備成本較高，影響了其工業(yè)化應(yīng)用。

芽孢桿菌具有較強的抗逆性，能耐熱、酸和堿等不良環(huán)境，可有效保持菌劑中的微生物活性，提高菌劑質(zhì)量及應(yīng)用效果王雪蓮等采用響應(yīng)面法對影響枯草芽孢桿菌B579的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，為進一步提高細胞濃度和后續(xù)放大培養(yǎng)提供參考，同時，對其產(chǎn)芽孢條件進行了優(yōu)化。王法國等通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗設(shè)計和響應(yīng)面法對解淀粉芽孢桿菌JT84的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，所得發(fā)酵液的芽孢含量為1.67×109CFU/mL，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，提高了159％。郭曉軍等通過對堆肥用產(chǎn)蛋白酶菌株的單因素、正交試驗產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，芽孢產(chǎn)率達95.0％，為解決以芽孢桿菌為主的微生物菌劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中存在的活性低等問題提供了重要參考。

作者采集污泥與秸稈混合好氧堆肥樣品，進行微生物初篩、復(fù)篩及分離純化，分子鑒定后獲得一株用于好氧堆肥的枯草芽孢桿菌GX2，具有耐高溫、耐酸等特點，將其應(yīng)用于堆肥過程能有效縮短堆肥周期，提高堆肥品質(zhì)。針對上述枯草芽孢桿菌GX2，通過搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化，在3L發(fā)酵罐中通過分批補料技術(shù)進一步提高細胞濃度，并通過單因素和正交試驗優(yōu)化產(chǎn)芽孢工藝條件，可為降低其發(fā)酵及菌劑制備成本提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

堆肥用菌株：好氧堆肥用枯草芽孢桿菌GX2為實驗室保存菌株；種子培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化鈉5g/L，pH為7.2±0.2；計數(shù)培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂15g/L，pH為7.0～7.2；搖瓶及3L發(fā)酵罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酪蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，pH7.3，消泡劑0.2％(體積分數(shù))；補料培養(yǎng)基：50g/L的蔗糖溶液；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硫酸錳、蔗糖和硝酸鈉：上海國藥集團產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化及種子液制備

將4℃冰箱內(nèi)保藏的菌株接入已滅菌的液體肉湯培養(yǎng)基中，搖床上45℃、160r/min活化12h后，在同體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上三區(qū)平板劃線，置于45℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑選三區(qū)單菌落傳代兩次后，作為發(fā)酵菌株使用。

挑取已活化的發(fā)酵菌株單菌落，接種于裝有100mL已滅菌的肉湯培養(yǎng)基250mL三角瓶中，置于搖床振蕩培養(yǎng)，在溫度為45℃，轉(zhuǎn)速為160r/min培養(yǎng)12h作為種子液。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化

在搖床發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以0D值為指標(biāo)，對菌株GX2進行碳源種類(葡萄糖、蔗糖、淀粉)、最佳碳源質(zhì)量濃度(5、10、20、30、40g/L)、氮源種類(酵母粉、氯化銨、硝酸鈉)、最佳氮源質(zhì)量濃度(5、10、15、20、25g/L)、裝液量(50、100、150、200mL)的單因素優(yōu)化。搖床培養(yǎng)的初始條件為溫度45℃，轉(zhuǎn)速160r/min,裝液量100mL(250mL)，pH7.3。實驗在同一時問取樣測定0D值來優(yōu)化培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件,優(yōu)化后的培養(yǎng)基用于發(fā)酵罐培養(yǎng)。每組試驗3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.3 發(fā)酵罐分批補料培養(yǎng)

發(fā)酵罐型號為B10TECH-3JG-3JG-9000D，上海保光公司產(chǎn)品。在前期搖床培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵罐初始條件設(shè)置為工作體積1.5L、壓力0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速300r/min、溫度45℃、接種量為1×107CFU/mL，通過流加3mol/L的Na0H和HCl將DH值自動控制在7.3。將3L發(fā)酵罐進行滅菌，然后裝入1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基于121℃滅菌30min，取出后將溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧設(shè)置在初始條件，以1×10⁷CFU/mL的接入量接種新鮮活化的GX2種子液。

分批發(fā)酵是在上述條件下上罐進行菌株發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中0D值、殘?zhí)菨舛?、活菌?shù)，獲得菌株在發(fā)酵罐上的補料時間和補料量。分批補料發(fā)酵是在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上，當(dāng)總糖量消耗一半時,加入碳源至原濃度，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)細胞濃度達到穩(wěn)定時停止補料發(fā)酵。以最大0D值和最大活細胞數(shù)作為參考值，來分析分批發(fā)酵和分批補料發(fā)酵的效果。

在分批補料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，取樣測定活菌數(shù)和芽孢數(shù)，繪制芽孢曲線圖。在產(chǎn)芽孢時開始控制條件來優(yōu)化芽孢率，并在芽孢率最大時取樣測定。

1.2.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化

1)單因素優(yōu)化芽孢率在發(fā)酵罐分批補料優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別研究培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和pH值對芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的影響。

2)正交試驗優(yōu)化芽孢率根據(jù)單因素實驗結(jié)果得到的pH(4)，溫度(B)、轉(zhuǎn)速(C)的基礎(chǔ)上，設(shè)計3因素3水平正交試驗，并根據(jù)正交試驗數(shù)據(jù)的極差分析，得到菌株產(chǎn)芽孢的最佳發(fā)酵條件。

3)追加驗證實驗根據(jù)正交試驗分析的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，進行追加驗證實驗。

1.3 分析測試項目與方法

細胞濃度：采用比色法，以空白培養(yǎng)基作參比.在600nm處測定發(fā)酵液0D值?；罴毎麛?shù)：采用稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法，發(fā)酵液進行10倍稀釋后，涂布平板進行活菌計數(shù)。

芽孢數(shù)：將發(fā)酵液在70℃下處理15min后。冷卻，采用稀釋梯度平皿計數(shù)法統(tǒng)計活菌數(shù)。

芽孢率：芽孢數(shù)占活菌數(shù)的百分數(shù)。

總糖含量：采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 生長曲線繪制

微生物菌株生長一般經(jīng)歷延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段。首先是菌體生長的遲滯期，生長緩慢，細胞濃度基本不會增加；適應(yīng)新環(huán)境后，微生物生長繁殖速度加快，細胞濃度快速提高，進入對數(shù)生長期：此后，隨著底物不斷被消耗，細胞濃度進入穩(wěn)定期：底物進一步消耗殆盡，微生物生長進入衰產(chǎn)期，細胞濃度明顯下降。繪制微生物菌株的生長曲線可為其培養(yǎng)條件優(yōu)化提供重要參考，圖1給出了枯草芽孢桿菌GX2的發(fā)酵液0D值隨培養(yǎng)時問的變化情況。

由圖1可知，細胞濃度在前期有短暫的生長停滯期，之后發(fā)酵液在波長600nm處的吸光度呈直線上升趨勢，至14h時，細胞濃度達到最大，A_600nm為1.698，之后開始下降。通常情況下，處于對數(shù)生長期的菌株活力最強，細胞濃度也最高，因此，確定14h為枯草芽孢桿菌GX2的最佳培養(yǎng)時間，并用作后續(xù)搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化研究的發(fā)酵終止時問。

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