2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

從云南省2個地區(qū)采摘的3個種的野生牛肝菌子實體，共分離出可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌23株，通過菌落形態(tài)初步判斷多數(shù)為木霉屬，從中篩選出具有菌落形態(tài)、顏色、氣味等差異大的4株菌種，接種于CPDA培養(yǎng)基上，在25℃下培養(yǎng)5d，平板生長的菌落形態(tài)、光學顯微鏡觀察的菌絲、孢子形態(tài)，利用MoticImagesPlus2.0軟件進行顯微形態(tài)（10×100）拍攝，如圖1所示，特征描述見表1。

2.2 4種內(nèi)生真菌菌株ITS序列PCR擴增結(jié)果

進一步進行分子生物學鑒定，以引物ITS1和ITS4對內(nèi)生真菌的DNA模板進行PCR擴增，獲得4條長度均在410～610bp之間的特異性片段，4株內(nèi)生真菌的ITS擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，如圖2所示。
 

2.3 4種內(nèi)生真菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及分析

利用ITS通用引物對4株內(nèi)生真菌進行序列擴增得到4條基因序列，序列長度分別是LCTG-12為580bp；LCCK-6為410bp；BSHC18為610bp；BBFO-10為600bp。將以上4條序列分別在NCBI庫中進行在線BLAST比對，每種菌下載4～5條同源性高于95%的序列，以測序得到的基因序列為基礎，同公共數(shù)據(jù)庫下載的相似序列合并，采用MEGA-X軟件，按照neighbor-joiningmethod，經(jīng)過自舉法1000次進行檢驗構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以此對菌株進行種水平的分類鑒別。4株菌在NCBI中BLAST比對結(jié)果顯示：在100條序列比對結(jié)果中，LCTG-12與76株木霉屬序列的序列同源性為99%以上，說明該菌為木霉屬；LCCK-6與55株念珠菌屬的序列同源性為90%以上說明該菌為念珠菌屬；BSHC-18與50株菌寄生屬的序列同源性為90%以上說明該菌為菌寄生屬；BBFO-10與94株的序列同源性為99%以上。

系統(tǒng)發(fā)育樹樹枝的長短表示各菌株之間的遺傳距離，同一支說明親緣關(guān)系很近，以系統(tǒng)發(fā)育方法可以對關(guān)系較為密切的菌株序列進行較好的判別。結(jié)合形態(tài)學鑒定及BLAST對比及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果：LCTG-12與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Trichodermagamsii聚類在同一支上，自檢支持率100%，鑒定該菌為蓋姆斯木霉；LCCK-6與Candidakruisii聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為克魯伊假絲酵母；BSHC-18與Hypomyceschrysospermus聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為黃瘤孢菌；BBFO-10與Fusariumoxysprum聚類于同一株上，自檢支持率達100%，鑒定該菌為尖孢鐮刀菌。

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