多糖是南10個以上的單糖單元以糖苷鍵連接組成的大分子，其廣泛參與細(xì)胞的黏附、免疫、增殖和分化。近年來，天然來源的多糖因其具有的生物學(xué)活性，在藥理學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注陽。目前，已有香菇多糖、靈芝多糖、黃芪多糖等幾種天然來源的多糖被應(yīng)用于臨床或臨床前研究。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有激活巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)TIB細(xì)胞和機體免疫的功能。桑葚多糖可增加NK細(xì)胞活性，促進(jìn)T/B淋巴細(xì)胞增殖，增強機體特異性和非特異性免疫。靈芝多糖可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，在癌癥免疫治療過程中誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖。同時，多糖具有補益心脾、緩解神經(jīng)疼痛和消除腫脹等功效。

龍眼是一種亞熱帶特色水果，除我國外，在南亞地區(qū)、美國和澳大利亞也有種植。目前我國龍眼種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。干制龍眼(桂圓)是我國藥典收錄的一味中藥，具有補益心脾、緩解神經(jīng)疼痛和消除腫脹的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，多糖是龍眼肉生物活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，報道顯示龍眼多糖具有抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生物活性。

由于龍眼產(chǎn)期集中，除鮮食外，其主要的加工方式為干制。文獻(xiàn)顯示，干燥過程可能會對多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性產(chǎn)生顯著影響。韓苗苗等對龍眼干燥過程中其總多糖的活性變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)熱風(fēng)干燥12～60h，其總多糖對DPPH、羥自南基清除能力和總抗氧化能力顯著提高：干燥12～24h時.總多糖抑制SGC7901和HepG2腫瘤細(xì)胞的能力顯著增強。但是由于沒有分析單一多糖組分的活性變化，作者推測多糖的生物活性差異可能與美拉德反應(yīng)關(guān)聯(lián)的多糖一蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)。基于以上研究背景，作者采用小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞模型，分析了分離純化獲得的新鮮和干制龍眼果肉多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，旨在為龍眼的精深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

龍眼(品種“儲良”)：購自廣州市天平架水果市場，65℃鼓風(fēng)干燥去皮、去核后的鮮龍眼至水分含量為11.4％，備用。小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)：中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院提供；昆明小鼠(SPF級)：購白海南省藥物研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清)和DMEM培養(yǎng)基：購白賽默飛世爾科技(中國)有限公司；中性紅、MTT(噻唑藍(lán))、LPS(脂多糖)：購自西格瑪奧德里奇公司；D301-R大孔吸附樹脂：購自南開大學(xué)樹脂公司；小鼠TNF-OL試劑盒、IL-6試劑盒：購自美國R&D公司：DEAE-FF陰離子交換樹脂：購自美國通用公司。AlphaLDPlus型真空冷凍干燥機：德國MARTINCHRIST公司產(chǎn)品：1200高效液相色譜儀(HPLC)：安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-IF型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SpectraMax190型全自動酶標(biāo)儀：美谷分子儀器(上海)有限公司產(chǎn)品：311型二氧化碳培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮龍眼和干龍眼多糖的制備

鮮龍眼多糖(LPX3)制備：新鮮龍眼去皮、去核，打漿，料液體積比為1:15，80℃水浴攪拌2h，200目紗布過濾。果渣復(fù)提2次。將合并的濾液濃縮至總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％～4％。體積分?jǐn)?shù)80％乙醇溶液醇沉24h，離心，少量蒸餾水復(fù)溶沉淀。加入D301-R大孔樹脂，在pH5.0、溫度48℃、料液體積比61:100、時間2h條件下脫色素和除蛋白質(zhì)。100目紗布過濾，濃縮后透析48h，濃縮得粗龍眼多糖。將陰離子交換樹脂裝入1.6cm×30.0cm的層析柱中，蒸餾水沖洗干凈后用pH9.0的Tris-HCl緩沖液平衡，上樣，流量為0.5mL/min。洗脫程序為：0.0mol/LNaCl洗脫30min，0.03mol/LNaCl洗脫120min，0.05mol/LNaCl洗脫60min。檢測洗脫峰，將0.05mol/LNaCl洗脫得到的組分濃縮，透析48h，濃縮得到粗龍眼多糖。得到的粗龍眼多糖采用安捷倫1200HPLC、TSKgel-G4000PWXL串聯(lián)TSKgel-G3000PWXL純化,以示差檢測器檢測并收集相應(yīng)均一組分，濃縮，冷凍干燥后得到LPX3。

干龍眼多糖(LPG2)制備：體積分?jǐn)?shù)80％的乙醇溶液浸泡干龍眼肉48h，陰干后打漿，80℃水浴浸提2h，料液體積比1:15，200目紗布過濾。果渣復(fù)提2次。提取純化過程同上所述。

1.2.2 小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的制備

小鼠推頸處死，移至超凈臺內(nèi)，取腸系膜淋巴結(jié)。剪碎過200目不銹鋼篩網(wǎng)，PBS沖洗2次，收集細(xì)胞。常溫1000r/min離心5min收集細(xì)胞，用適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度。37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO₂培養(yǎng)備用。

1.2.3 腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞增殖能力的測定

腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞增殖能力的測定參照文獻(xiàn)，簡述如下：細(xì)胞濃度調(diào)整至5×10⁶個/mL，接種至96孔板。樣品組用不同質(zhì)量濃度(6.25、25、200μL)的LPX3和LPG2孵育細(xì)胞。以等量RPMI-1640完全培養(yǎng)基為空白對照組，并設(shè)置6個平行。培養(yǎng)72h后加入MTT溶液(5.0mg/mL)20ILL，37℃孵育4h。加入三聯(lián)液100μL，37℃再次孵育4h。酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度。計算公式如下：

式中：I為細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)，％；A₁為不同質(zhì)量濃度LPX3和LPG2組腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞加入MTT和三聯(lián)液處理后在490nm處吸光度；A₂為空白對照組腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞加入MTT和三聯(lián)液處理后在490nm處吸光度。

1.2.4 巨噬細(xì)胞增殖能力的測定

巨噬細(xì)胞增殖能力的測定參照文獻(xiàn)方法執(zhí)行，簡述如下：調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL，接種至96孔板培養(yǎng)2.0h，吸去培養(yǎng)基。加入100μLDMEM完全培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO₂培養(yǎng)12h后吸去培養(yǎng)基。樣品組加入不同質(zhì)量濃度(100、200、400μg/mL)LPX3和LPG2?？瞻讓φ战M加入等量的DMEM完全培養(yǎng)基，每組6個平行。培養(yǎng)24h后加入MTT溶液(5.0mg/mL)20μL，37℃繼續(xù)孵育4.0h。吸去培養(yǎng)基，加入DMSO150μL。酶標(biāo)儀振蕩10min后，測定490nm處吸光度。計算公式如下：

式中：I為細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)，％；A₃為不同質(zhì)量濃度LPX3和LPG2組巨噬細(xì)胞加入MTT和三聯(lián)液處理后在490nm處吸光度：A₄為空白對照組巨噬細(xì)胞加入MTT和三聯(lián)液處理后在490nm處吸光度。

1.2.5 巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定

巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定參照文獻(xiàn)，簡述如下：調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10⁵個/mL，接種至96孔板培養(yǎng)2.0h后，吸去培養(yǎng)基。加入100μLDMEM完全培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)12h后吸去培養(yǎng)基。樣品組加入不同質(zhì)量濃度(50、200、400μg/mL)的LPX3和LPG2。空白對照組加入等量的DMEM完全培養(yǎng)基，陽性對照組加入等量LPS(5μg/mL)，每組6個平行。37℃孵育24h，PBS清洗2次后加入100μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％中性紅溶液。37℃孵育1h后用PBS洗掉未吞噬的中性紅。加入200μL細(xì)胞裂解液(乙醇和冰乙酸體積比為1:1)，4℃靜置過夜，酶標(biāo)儀測定540nm處吸光度。計算公式如下：

式中：S為吞噬分?jǐn)?shù)，％；A₅組為不同質(zhì)量濃度LPX3和LPG2組巨噬細(xì)胞加入中性紅溶液處理后在540nm處吸光度；A₆為對照組巨噬細(xì)胞加入中性紅溶液處理后在540nm處吸光度。

1.2.6 巨噬細(xì)胞NO、1L-6和TNF-α分泌量的測定

巨噬細(xì)胞N0、IL-6和TNF-α分泌量的測定參照文獻(xiàn)，簡述如下：調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL，接種2.0h后，吸去培養(yǎng)基。加入100μLDMEM完全培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO₂培養(yǎng)12h，吸去培養(yǎng)基。樣品組加入200μL相應(yīng)質(zhì)量濃度的LPX3和LPG2?？瞻讓φ战M加入等量的DMEM培養(yǎng)基，陽性對照組加人等量LPS(5μg/mL)，每組6個平行。37℃培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液5000r/min離心5min，上清液中IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度用ELISA試劑盒檢測。NO測定組每孔加入50μL的NO熒光探針。37℃孵育30.0min后PBS清洗3次。熒光顯微鏡下觀察并測定熒光強度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NO分泌量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。組問顯著性分析采用SPSS22.0軟件，單因素分析法(ANOVA)，Duncan檢驗，置信度為P＜0.05。

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