2.2.3 固定化EC降解酶的乙醇耐受性

EC降解酶的乙醇耐受性在酒精飲料的應(yīng)用中非常重要。從圖6可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的升高，游離酶和固定化EC降解酶酶活均隨之下降，但固定化EC降解酶對乙醇表現(xiàn)出良好的耐受性。在乙醇體積分數(shù)為7％～25％時，同定化EC降解酶酶活均能保留50％以上.同游離酶的乙醇耐受性相比，變化有一定差異，初步推測此固定化方法對其乙醇耐受性和酶活提高有一定影響。說明此固定化EC降解酶與游離酶相比，在乙醇體積分數(shù)相對較低時可以保持相對較高的酶活，適用于乙醇體積分數(shù)相對較低的發(fā)酵酒精飲料。

2.2.4 固定化KC降解酶的重復(fù)使用性

如圖7所示，在模擬酒樣對固定化EC降解酶進行重復(fù)性實驗，結(jié)果顯示，每次使用后酶活均有下降。當(dāng)重復(fù)使用8次以后，固定化EC降解酶酶活力保留在50％以上，因此在8次前使用效果較好。

此結(jié)果與文獻報道的GO-CS復(fù)合同定酸性酶使用10次時的酶活80％相比，可使用次數(shù)稍顯劣勢圈，但就所得固定化酶而言，仍然可以考慮將使用次數(shù)盡量控制在8次以內(nèi)以獲得更好的效果。

2.2.5 固定化EC降解酶的儲存穩(wěn)定性

固定化EC降解酶在不同儲存溫度隨貯藏時問的酶活變化如圖8所示。在4℃條件下，酶活隨時問逐漸降低，酶活降低速率在1～3周和4～6周的變化都較平穩(wěn)，而在3～4周的變化最大：且貯藏6周之內(nèi)，酶活損失不足30％。在20℃條件下，酶活隨時間延長逐漸降低，至第5周時基本保持不變，但在貯藏6周之后，酶活僅達到60％。說明貯藏溫度對同定化EC降解酶的酶活有一定影響，但不是唯一因素。因此在該實驗條件下，盡量將固定化酶保藏在4～20℃，但基于固定化酶最適反應(yīng)溫度和出于經(jīng)濟節(jié)約方面的考慮，以20℃作為最佳貯藏溫度條件。

2.3 固定化酶對“美樂”葡萄酒的影響

2.3.1 固定化酶在“美樂”葡萄酒中的穩(wěn)定性

如圖9所示，隨著靜置時間增加，游離酶和固定化EC降解酶酶活均呈現(xiàn)下降趨勢，但存整個過程中，固定化酶酶活均高于游離酶酶活。當(dāng)靜置96h時，固定化酶酶活與游離酶酶活相差最大，相較于起初酶活差異，后期的差異更大，可能是南于相同酶量的條件下，起初游離酶更容易與底物接觸，而隨著時間推移，固定化酶由于載體的保護作用，仍能慢慢顯示出較高的酶活性。靜置144h之前，固定化酶酶活的損失率在50％以下，說明此酶可以適應(yīng)“美樂”葡萄酒的微環(huán)境，用于葡萄酒中EC的去除。

2.3. 2固定化酶對“美樂”葡萄酒中EC的去除率

“美樂"葡萄酒樣品中添加等量酶活的固定化EC降解酶和游離酶一段時間后，樣品中EC質(zhì)量濃度逐漸降低。

從圖10可以看出,樣品中加酶處理后,處理組的EC質(zhì)量濃度均低于對照組，處理組的EC去除率高于對照組，說明無論是游離還是固定化EC降解酶的處理,均使“美樂”葡萄酒中EC質(zhì)量濃度得到了降低，但游離酶酶法去除EC的效果要優(yōu)于固定化酶處理法。在該實驗條件下,固定化EC降解酶對“美樂”葡萄酒中EC的去除率可達30.90%,是游離酶的81.53%。

2.3.3 固定化酶對“美樂”葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的影響

葡萄酒的風(fēng)味不是獨立存在的，而是由醇、酯、酸、醛、酮、萜類化合物和C13-萜烯類化合物相互協(xié)調(diào)而產(chǎn)生的，它們共同構(gòu)成了葡萄酒香氣的組成成分。對“美樂”葡萄酒中香氣化合物及其相對含量進行了定性和定量分析。

對照組和處理組的葡萄酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量如表1所示，在3種處理方式下的葡萄酒巾，共檢測到29種香氣成分，包括12種酯類、9種醇類、3種有機酸和5種醛、酮、酚類。經(jīng)分析可知，不同處理組中各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量之間無顯著差異，但是相較于對照組，處理組的物質(zhì)種類均有所減少，其中固定化酶處理組減少了8種物質(zhì)，而游離酶處理組減少了12種物質(zhì)。說明酶處理對葡萄酒巾揮發(fā)性物質(zhì)的種類數(shù)量有些許影響，但對化合物的相對含量影響不顯著，而且，固定化酶處理方式對葡萄酒更加友好。相比對照組.酶處理組中的物質(zhì)均出現(xiàn)了數(shù)量的減少，但消失的物質(zhì)并不相同，固定化酶處理組減少的物質(zhì)包括：香茅醇、正癸醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和異丙醇。而游離酶處理組減少的物質(zhì)分別是香茅醇、盧一大馬士酮、糠醛、正癸醛、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、2，3一丁二醇、異丙醇、1一己醇。說明不同類型的酶處理對葡萄酒的影響不同，但考慮到游離酶引起芳香味和果香味物質(zhì)的損失更大，F(xiàn)向于在考慮風(fēng)味復(fù)雜性時要避免不愉快風(fēng)味的發(fā)展，因此建議對“美樂”葡萄酒使用固定化EC降解酶進行處理。

此外，不同處理組測得的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的組成也有明顯不同。表1和圖11顯示了“美樂”葡萄酒中不同酶處理方式下主要揮發(fā)性香氣成分(醇、酯類、酸和醛)的變化規(guī)律。

南C6化合物、揮發(fā)性酚類物質(zhì)和苯類化合物組成的香氣成分在“美樂”葡萄酒中隨著酶處理方式的不同而呈現(xiàn)出不同的趨勢。酶處理后醇類和醛類占比降低，而酯類和酸類均有所增加，其他類基本保持不變，表明不同的酶處理方式對揮發(fā)性香氣化合物產(chǎn)生了一定影響。盡管酶處理方式對葡萄酒巾揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量沒有顯著影響，但引起了香氣物質(zhì)種類的減少和香氣成分的改變，且游離酶對其不利影響要大于同定化酶。因此，在人們接受風(fēng)味有所改變的前提下，同定化EC降解酶更適合用于“美樂”葡萄酒。

3 結(jié)語

通過對殼聚糖與戊二醛的交聯(lián)條件進行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，以體積分數(shù)5％的戊二醛溶液作交聯(lián)劑，交聯(lián)反應(yīng)進行8h時，載體對酶的固定量達到最大。之后對EC降解酶的酶學(xué)性質(zhì)展開分析，得到如下結(jié)果：固定化EC降解酶的最適溫度是42℃，在此溫度下放置24h時相對酶活達60％以上；其最適DH是3.6，在此條件下放置24h的相對酶活大于60％：在體積分數(shù)7％～25％乙醇下，酶活均保持在50％以上，說明該固定化酶的乙醇耐受范圍廣，催化活性高：該酶在重復(fù)使用8次后，酶活還保持在50％以上.而且分別在4℃和20℃下貯藏6周后的酶活損失率不足30％幣H40％。最后，采用ATPS結(jié)合GC-MS檢測不同酶處理的“美樂”葡萄酒中含有的EC，得知同定化EC降解酶的EC去除率達30.90％，是游離酶的81.53％。EC降解酶的處理方式對葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量沒有顯著影響，只是引起了香氣物質(zhì)種類的減少和香氣成分的改變，但固定化酶對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的不利影響遠低于游離酶。

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