2.4菌株L2-003-A-5的鑒定

2.4.1菌株L2-003-A-5的形態(tài)特征

菌株L2-003-A-5在掃描電鏡下的形態(tài)如圖2所示，菌株的氣生菌絲明顯呈卷曲螺旋狀；孢子呈短圓柱形，孢子的表面平滑；菌絲生長(zhǎng)能力旺盛、分支明顯，可見(jiàn)散落的孢子分布。菌株L2-003-A-5在高氏一號(hào)瓊脂中生長(zhǎng)迅速(圖3)，其氣生菌絲呈白色，基內(nèi)菌絲呈淡黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。將菌株L2-003-A-5在8種培養(yǎng)基中培養(yǎng)和觀察，結(jié)果顯示，氣生菌絲和基內(nèi)菌絲以白色偏淡黃為主，無(wú)可溶性色素產(chǎn)出，在酵母膏-麥芽膏瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂等3種培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)較差(表2)。

2.4.2菌株L2-003-A-5的生理生化特征

菌株L2-003-A-5生長(zhǎng)的pH范圍是6～9，最適pH為7；對(duì)NaCl耐受能力較差，只能在含1%NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且長(zhǎng)勢(shì)較差；生長(zhǎng)溫度為25～40℃，最適溫度為30℃；淀粉水解、纖維素水解、油脂水解、甲基紅、牛奶凝固和過(guò)氧化氫酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，明膠液化反應(yīng)、產(chǎn)H2S、檸檬酸鹽反應(yīng)、硝酸鹽還原和苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)呈陰性。

2.4.3菌株L2-003-A-516SrRNA基因部分序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示，菌株L2-003-A-5的16SrRNA基因部分序列長(zhǎng)度為1493bp，在GenBank核酸登錄號(hào)為KT119348。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株L2-003-A-5屬于鏈霉菌屬細(xì)菌，與典型菌株Streptomy-cessomaliensisNBRC12916T、Streptomycesalbidofla-vusDSM40455T、氫化鏈霉菌(Streptomyceshydroge-nans)NBRC13475T、淺紫鏈霉菌(Streptomycesviola-scens)ISP5183T、StreptomycesdaghestanicusNRRLB-5418T和StreptomyceskoyangensisVK-A60T聚為一簇，與這些菌株的16SrRNA基因相似性均為99.9%；與典型菌株StreptomycesdaghestanicusNRRLB-5418T和StreptomyceskoyangensisVK-A60T的16SrRNA基因相似性分別為99.7%和99.4%。通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株L2-003-A-5及相關(guān)菌株16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示。綜合分析與菌株L2-003-A-5相似性最近的菌株的形態(tài)特征、生理生化特征和16SrRNA基因序列比對(duì)(Rongetal,2009；魏玉珍等,2010；秦盛等,2009；譚力等,2015；王毓舒,2011；Kye,Yong,1993)，判斷L2-003-A-5為一株微白黃鏈霉菌(Streptomycesalbidoflavus)。

2.5菌株SC-168-A-2的鑒定

2.5.1菌株SC-168-A-2的形態(tài)特征

菌株SC-168-A-2在掃描電鏡下的形態(tài)如圖2所示，菌株的氣生菌絲呈長(zhǎng)直孢子鏈狀；孢子呈短圓柱形，四周呈內(nèi)陷形態(tài)；菌絲生長(zhǎng)能力旺盛、分支明顯。在供試的8種培養(yǎng)基中，SC-168-A-2的氣生菌絲以白色為主，基內(nèi)菌絲以淡黃或白色為主；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況較差(表2)，在包括高氏一號(hào)培養(yǎng)基(圖3)在內(nèi)的培養(yǎng)基中均不產(chǎn)生可溶性色素。

2.5.2菌株SC-168-A-2的生理生化檢測(cè)

適于菌株SC-168-A-2生長(zhǎng)的pH范圍是6～9，最適pH為7和8；菌株SC-168-A-2能耐受8%Na‐Cl；生長(zhǎng)溫度范圍為15～45℃，最適溫度為30℃；淀粉水解、纖維素水解、油脂水解、牛奶凝固、產(chǎn)H2S反應(yīng)、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)和甲基紅反應(yīng)呈陽(yáng)性，明膠液化、硝酸鹽還原和苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)呈陰性。

2.5.3菌株SC-168-A-216SrRNA基因部分序列分析

菌株SC-168-A-2的16SrRNA基因部分序列長(zhǎng)度為1436bp，在GenBank核酸登錄號(hào)為KR140205。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株SC-168-A-2屬于鏈霉菌屬，與典型菌株Streptomycespraten-sisch24T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，16SrRNA基因相似性為99.8%；與另外3個(gè)典型菌株Streptomycesgriseopla-nusAS4.1868T、StreptomycescyaneofuscatusJCM4364T和StreptomycesanulatusNRRLB-2000T的16SrRNA基因相似性分別為99.1%、98.5%和98.3%。綜合分析形態(tài)特征、生理生化特征和16SrRNA基因部分序列(楊桂柳等,2015；Kimetal,2012)，判定菌株SC-168-A-2屬于鏈霉菌屬的Streptomycespratensis。通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株SC-168-A-2及相關(guān)菌株16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖6所示。

3討論

本研究篩選了3株對(duì)煙草青枯病原菌拮抗效果良好的放線菌，經(jīng)鑒定均為鏈霉菌，而目前已見(jiàn)報(bào)道的拮抗煙草青枯病原菌的放線菌種類絕大多數(shù)也是鏈霉菌，本研究結(jié)果驗(yàn)證了鏈霉菌在這方面的良好效果。已報(bào)道的能拮抗煙草青枯病原菌的鏈霉菌種類主要包括薰衣草鏈霉菌(S.lavendulae)(張薇,2009)、橄欖綠鏈霉菌(S.olivaceoviridis)、粉紅孢類群玫瑰暗黃鏈霉菌(S.roseofulvus)(陸錚錚,蔣選利,2015)、婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)(王巖,2009)等，本研究結(jié)果豐富了鏈霉菌拮抗煙草青枯病原菌的種類。另外，已有的研究表明，可用于農(nóng)業(yè)生物防治的放線菌中60%是鏈霉菌(Tanaka,Omura,1993)，這可能是因?yàn)殒溍咕?u>革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌放線菌科中最大的屬，種類繁多，在各種生活環(huán)境中分布廣泛，更重要的是鏈霉菌可以產(chǎn)生大量種類豐富的活性次生代謝產(chǎn)物(Kimetal.,2003；Parketal.,2008；Wangetal.,2007)，這些代謝產(chǎn)物具有多樣的功能，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域。本研究篩選所得的鏈霉菌種類也有在農(nóng)業(yè)生物領(lǐng)域的報(bào)道，如S.microflavus具有促進(jìn)植株生長(zhǎng)(張琪等,2018；郭建軍等,2013)、產(chǎn)生抗菌活性(王磊,2011；黃燦等,2007)等特性，S.albidoflavus也有抗菌能力(張?chǎng)埖?2012；周麗娜等,2015；戚珊珊,2011；于素亞等,2012)，但這些微生物在拮抗煙草青枯病原菌的特性方面鮮有報(bào)道。另外，目前報(bào)道的多數(shù)煙草病原菌的拮抗微生物不止對(duì)一種病原菌具有抑制作用(易有金,2007；展麗然等,2008；王娜娜,2012)，而此特性是拓寬拮抗微生物應(yīng)用范圍的重要基礎(chǔ)。本研究所篩選獲得的拮抗放線菌對(duì)赤星病菌及辣椒、番茄、馬鈴薯等茄科類植物青枯病菌均有抑制作用，抑菌范圍廣，提示各拮抗菌株具有用于研制生物有機(jī)肥的潛力，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究的價(jià)值。

4結(jié)論

本研究從四川2個(gè)煙草種植區(qū)的根際土中分離篩選獲得3株拮抗煙草青枯病原菌的放線菌；對(duì)抑菌譜的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該3株菌不僅對(duì)煙草青枯病原菌具有較好的拮抗效果，對(duì)煙草赤星病及辣椒、番茄、馬鈴薯青枯病的病原菌均有抑制效果。結(jié)合表型特征、生理生化特征和遺傳特征分析，確定3株放線菌均為鏈霉菌，分別屬于Streptomycesmicroflavus、Streptomycesalbidoflavus和Streptomycespratensi。

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