早期，人們?cè)褂美w維素作為免疫親和色譜的固相基質(zhì)，其較差的耐壓性導(dǎo)致柱流動(dòng)性差而未被繼續(xù)使用。現(xiàn)在常用的載體有瓊脂糖凝膠、多孔玻璃、高分子涂層硅膠、聚丙烯酰胺凝膠等。

3、免疫親和色譜固相基質(zhì)的活化與耦聯(lián)

大部分免疫親和色譜固相基質(zhì)在與配體(如--抗體)共價(jià)耦聯(lián)之前，均需要進(jìn)行活化。為了使配體能夠突出于固相基質(zhì)表面，可以在配體和固相基質(zhì)之間引入一個(gè)“間隔臂”，如可利用戊二醛的兩個(gè)醛基分別與基質(zhì)和配體共價(jià)連接。通常配體與基質(zhì)的耦聯(lián)方法是先在基質(zhì)骨架上引入親電基團(tuán)，再與“間隔臂”或抗體上的親核基團(tuán)(如-NH₂、-OH、-COOH等)共價(jià)結(jié)合。

在小配體的免疫親和色譜中，需要在基質(zhì)和配體之間插一個(gè)“間隔臂”，以減少空間位阻的影響。在農(nóng)藥殘留免疫親和色譜中，配體是抗農(nóng)藥抗體，分子大，目標(biāo)分析農(nóng)藥與抗體的結(jié)合一般不會(huì)受空間位阻的影響。相反，“間隔臂”的引入、特別是疏水性“間隔臂”的引入反而增加了非特異性吸附的機(jī)會(huì)。

CNB_r法最早由Axen等(1967)提出，屬經(jīng)典的活化方法，具有方法簡單、活化效果好特點(diǎn)，但是本法有操作CNBr的危險(xiǎn)，特別是該法引入了陰離子交換基團(tuán)異脲衍生物(pK_a=10.4)，成為CNBr活化基質(zhì)增加非特異性吸附的重要原因。CNBr法制備的免疫親和色譜固定相在使用過程可能發(fā)生抗體的流失問題。

Bethell等(1979)建立了目前被認(rèn)為最優(yōu)良的羰基二咪唑(carbonyldimidazole，CDI活化法。羰基二咪唑法活化與耦聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物只有一個(gè)，即N-取代氨基甲酸酯衍生物，反應(yīng)過程較CNBr簡單，活化效率較CNBr法高數(shù)十倍，與抗體的耦聯(lián)率可與CNBr法相媲美。

抗體與活化基質(zhì)的耦聯(lián)分為隨機(jī)耦聯(lián)與定向耦聯(lián)兩種方式。

所謂隨機(jī)耦聯(lián)，就是指將活化好的基質(zhì)耦聯(lián)在純化抗體的不確定部位。隨機(jī)耦聯(lián)存在著一些問題：①基質(zhì)與抗體耦聯(lián)時(shí)，抗體的定位不準(zhǔn)確，抗原結(jié)合位點(diǎn)容易被占，導(dǎo)致抗體的免疫學(xué)活性降低或喪失；②抗體與基質(zhì)多點(diǎn)結(jié)合，使空間位阻加大，阻礙抗原接近結(jié)合位點(diǎn)。所以隨機(jī)耦聯(lián)后抗體的活性一般僅為游離抗體的1％～30％。

所謂定向耦聯(lián)，就是選擇性地將抗體的非抗原結(jié)合部位與固相基質(zhì)共價(jià)耦聯(lián)。目前，基質(zhì)與抗體定向耦聯(lián)方法主要有3種。①先將蛋白A或蛋白G固定在固相基質(zhì)上，然后再與多抗(或單抗)相結(jié)合。因?yàn)榈鞍譇或蛋白G與IgG有很強(qiáng)的親和力且只與抗體的非抗原結(jié)合部位(IgG的恒定區(qū))結(jié)合，從而可使抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)游離。該法的缺點(diǎn)是蛋白A或蛋白G與抗體的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，作為配體的抗體在色譜過程中容易受條件影響而流失。②先將抗體或抗體F舳片段用13一巰基乙醇還原，使抗體的鉸鏈區(qū)打開，生成自由的巰基，然后與含碘乙?；鶊F(tuán)的基質(zhì)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的硫醚鍵而耦聯(lián)于基質(zhì)上?？贵w的抗原結(jié)合部位不含巰基，耦聯(lián)后不影響抗體的抗原結(jié)合部位，但還原后的抗體其穩(wěn)定性會(huì)受到一定影響。③將抗體恒定區(qū)糖類中的羥基在溫和條件下用高碘酸鹽氧化，或?qū)⒛┒税肴樘菤埢c半乳糖氧化酶反應(yīng)，形成醛基后與含酰肼的基質(zhì)耦聯(lián)。定向耦聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)是不影響抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，可保持抗體的高免疫學(xué)活性，提高免疫親和色譜柱的親和容量。

4、免疫親和色譜柱的制備

將抗體與固相基質(zhì)的耦聯(lián)物(免疫親和色譜固定相或稱為免疫吸附劑)加在適當(dāng)緩沖液中，輕輕搖勻后加至底部有篩板的玻璃柱或聚乙烯柱中，讓免疫吸附劑自然沉降，打開柱出口，用緩沖液平衡后關(guān)閉柱出口。

5、免疫親和色譜柱性能評(píng)價(jià)與免疫親和色譜條件的選擇

(1)免疫親和色譜柱容量的測定：柱容量是免疫親和色譜中具有重要實(shí)用價(jià)值的參數(shù)，分為動(dòng)態(tài)柱容量(μg/mL柱床)和絕對(duì)柱容量(μg/mg IgG)。在免疫親和色譜條件已經(jīng)確定的情況下，測定柱容量最方便的方法是將一定濃度、超過理論容量的目標(biāo)分析物溶液通過免疫親和色譜柱，待柱飽和(出柱濃度與人柱濃度相同)后，洗滌去除柱內(nèi)游離物，用適當(dāng)溶劑完全洗脫目標(biāo)分析物，測定其含量，從而可計(jì)算出柱容量。免疫親和色譜柱在使用和儲(chǔ)存過程中應(yīng)定期檢測柱容量的變化。

(2)吸附與洗滌介質(zhì)的選擇：將一系列不同pH、不同離子強(qiáng)度及不同化學(xué)組成的緩沖液分別用作平衡免疫親和色譜柱、分離富集目標(biāo)分析物和洗滌免疫親和色譜柱的流動(dòng)相，測定不同條件下的柱容量，選擇柱容量最大的緩沖液作為平衡免疫親和色譜柱、分離富集目標(biāo)分析物和洗滌免疫親和色譜柱的流動(dòng)相。

(3)洗脫條件的選擇：免疫親和色譜柱中的目標(biāo)分析物的洗脫可采用不同方法，如改變緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、極性，或使用變性劑(脲、胍等)、去垢劑和離子序列高的離子配制洗脫劑。對(duì)于農(nóng)藥小分子，常采用在緩沖液中加入適當(dāng)能與水互融的有機(jī)溶劑(如甲醇等)作洗脫劑，洗脫液可直接用于高效液相色譜儀或氣相色譜儀分析。在樣品提取液中雜質(zhì)含量高的情況下，為了提高免疫親和色譜的效率，有時(shí)需要在免疫親和色譜分離凈化和富集前適當(dāng)增加凈化步驟，以去除樣品提取液中的大量雜質(zhì)。

參考資料：農(nóng)藥殘留分析，版權(quán)歸原作者所有，如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系。

相關(guān)鏈接：瓊脂糖凝膠，羰基二咪唑，免疫親和色譜