1、安全要求

實(shí)驗(yàn)操作時穿工作服、戴口罩和手套；提取和凈化操作都應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，避免溶劑氣體吸人和皮膚接觸；廢棄的化學(xué)試劑收集到專用容器中集中處理。

2、急救措施

皮膚接觸到有機(jī)溶劑或酸、堿溶液后用清水清洗，有機(jī)溶劑或酸、堿溶液濺人眼中用清水灌洗。

3、適用范圍

該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程適用于牛奶中吡利霉素殘留量的確證檢測。

4、職責(zé)

進(jìn)行該項(xiàng)檢驗(yàn)的檢驗(yàn)員必須按該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，質(zhì)量監(jiān)督員負(fù)責(zé)監(jiān)督該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的正確執(zhí)行。

5、原理

試料中殘留的毗利霉素用1％甲酸乙腈溶液提取，MCX固相萃取柱凈化，氮?dú)獯蹈蓾饪s，以高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測定，異吡利霉素作內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法定量。

6、方法靈敏度

吡利霉素在牛奶中的檢出限為2μg/kg，定量限為5μg/kg。

7、注意事項(xiàng)

在固相萃取預(yù)洗、淋洗和洗脫過程中應(yīng)注意流速，不能過快或過慢。

8、材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

8.1 對照品、試劑和藥物儲備液、工作液準(zhǔn)備；

8.1.1 吡利霉素對照品 含C₁₇H₃₁ClN₂O₅S不得少于97.0％；

8.1.2 異吡利霉素對照品 含C₁₇H₃₁ClN₂O₅S不得少于94.0％；

8.1.3 甲酸；

8.1.4 乙腈 色譜純；

8.1.5 正丙醇；

8.1.6 乙酸銨；

8.1.7 甲醇 色譜純；

8.1.8 1％甲酸的50mmol／L乙酸銨溶液 取乙酸銨0.77g，置200mL量瓶中，加2mL甲酸，用水溶解稀釋至刻度，搖勻即得。

8.1.9 1％甲酸乙腈溶液 量取1mL甲酸，置100mL量瓶中，用乙腈稀釋并定容，搖勻即得。

8.1.10 2％甲酸水溶液 量取2mL甲酸，置100mL量瓶中，用超純水稀釋并定容，搖勻即得。

8.1.11 5％氨水甲醇溶液 量取5mL氨水，置100mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻即得。

8.1.12 吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1mge／mL) 精密稱定鹽酸吡利霉素對照品約11.23mg，置10mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20％以下保存，有效期為3個月。

8.1.13 異吡利霉素內(nèi)標(biāo)儲備液(1mg/mL) 精密稱定鹽酸異吡利霉素對照品約11.59mg，置10mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1mg/mL，-20℃以下保存，有效期為3個月。

8.1.14 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制(1μg/mL) 準(zhǔn)確量取0.1mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即成10μg/mL吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液；從中量取1.0mL，置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻即得lμg/mL吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20℃以下保存，有效期為1個月。

8.1.15 內(nèi)標(biāo)工作液配制(1μg/mL) 準(zhǔn)確量取0.1mL內(nèi)標(biāo)儲備液，置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即成10μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液；從中量取1.0mI。內(nèi)標(biāo)工作液，置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻即得1μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。-20℃以下保存，有效期為1個月。

8.2 儀器和設(shè)備；

8.2.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)；

8.2.2 天平感量0.01g；

8.2.3 分析天平 感量0.00001g；

8.2.4 渦旋混合器；

8.2.5 離心機(jī)；

8.2.6 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；

8.2.7 氮吹儀；

8.2.8 離心管50mI。

8.2.9 微孔濾頭0.45μm；

8.2.10 雞心瓶，50mL；

8.2.1l 固相萃取裝置；

8.2.12 MCX固相萃取柱(60mg/3mL)，或相當(dāng)者。

9、檢驗(yàn)步驟

9.1 試料的制備；

9.1.1 取新鮮或解凍的供試樣品，作為供試試料。

9.1.2 取新鮮或解凍的空白樣品(2±0.02)g，作為空白試料。

9.1.3 取新鮮或解凍的空白樣品(2±0.02)g，添加1斗∥mL標(biāo)準(zhǔn)工作液0.2mL，作為空白添加試樣(陽性對照)。

9.2提取

9.2.1 取試料(2±0.02)g，置50m1．離心管，加入內(nèi)標(biāo)工作液0.2mL，再加入1％甲酸乙腈溶液5mL，渦旋混合提取10s，5000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至50mL雞心瓶。

9.2.2 離心管中的沉淀物用l％甲酸乙腈溶液5mL重復(fù)提取1次，合并上清液，加正丙醇3mL，于50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

9.2.3 殘余物用含1％甲酸的50mmol/L乙酸銨溶液5mL溶解，備用。

9.3 凈化

9.3.1 MCX小柱依次用甲醇、水各3mL預(yù)洗。

9.3.2 取全部備用液過柱。

9.3.3 用2％甲酸水溶液、甲醇各3mL淋洗，減壓抽干。

9.3.4 用5％氨水甲醇溶液3mL洗脫，抽干，洗脫液全部回收。

9.3.5 洗脫液于60％氮?dú)庀麓蹈?。殘余物?.0mL甲醇溶解，搖勻，經(jīng)微孔濾頭過濾后，供高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

9.4 測定

9.4.1 色譜條件；

9.4.1.1 色譜柱：XBridge C₁₈150mm×2.1mm(i.d.)，粒徑5μm，或相當(dāng)者；

9.4.1.2 流動相：乙腈+0.0lmol/L乙酸銨(30+70，v/v)；

9.4.1.3 流速：0.2mL／min；

9.4.1.4 柱溫：30℃；

9.4.1.5 進(jìn)樣量：10μL。

9.4.2 質(zhì)譜條件

9.4.2.1 離子源參考參數(shù)，電噴霧離子源(ESI⁺)，毛細(xì)管電壓為3.4 kV，錐孔電壓為34 V，萃取電壓為3 V，RF透鏡電壓為lV；源溫為105℃，脫溶劑溫度為350℃；錐孔氣流速為50 L／h，霧化氣流速為450L／h。

9.4.2.2質(zhì)量分析器參考參數(shù)見表。

9.4.2.3光電倍增器電壓：650V。

9.4.2.4定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表。

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