目前現(xiàn)行標注是(5009.33-2016)食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定，標準中規(guī)定了3種方法：第一法 離子色譜法、第二法 分光光度法、第三法 蔬菜、水果中硝酸鹽的測定 。紫外分光光度法目前大多數(shù)企業(yè)會選擇使用第二法分光光度法。

亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測定,硝酸鹽采用鎘柱還原法測定。試樣經(jīng)沉淀蛋白質、除去脂肪后,在弱酸條件下,亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后,再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料,外標法測得亞硝酸鹽含量。采用鎘柱將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,測得亞硝酸鹽總量,由測得的亞硝酸鹽總量減去試樣中亞硝酸鹽含量,即得試樣中硝酸鹽含量。

一、試劑及標準溶液的配制

試劑配制：

1 亞鐵氰化鉀溶液(106g/L):稱取106.0g亞鐵氰化鉀,用水溶解,并稀釋至1000mL。 

2 乙酸鋅溶液(220g/L):稱取220.0g乙酸鋅,先加30mL冰乙酸溶解,用水稀釋至1000mL。 

3 飽和硼砂溶液(50g/L):稱取5.0g硼酸鈉,溶于100mL熱水中,冷卻后備用。 

4 氨緩沖溶液(pH9.6~9.7):量取30mL鹽酸,加100mL水,混勻后加65mL氨水,再加水稀釋 至1000mL,混勻。調(diào)節(jié)pH 至9.6~9.7。 

5 氨緩沖液的稀釋液:量取50mLpH9.6~9.7氨緩沖溶液,加水稀釋至500mL,混勻。 

6 鹽酸(0.1mol/L):量取8.3mL鹽酸,用水稀釋至1000mL。 

7 鹽酸(2mol/L):量取167mL鹽酸,用水稀釋至1000mL。 

8 鹽酸(20%):量取20mL鹽酸,用水稀釋至100mL。 

9 對氨基苯磺酸溶液(4g/L):稱取0.4g對氨基苯磺酸,溶于100mL20%鹽酸中,混勻,置棕色 瓶中,避光保存。 

10 鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L):稱取0.2g鹽酸萘乙二胺,溶于100mL水中,混勻,置棕色瓶中, 避光保存。 

11 硫酸銅溶液(20g/L):稱取20g硫酸銅,加水溶解,并稀釋至1000mL。 

12 硫酸鎘溶液(40g/L):稱取40g硫酸鎘,加水溶解,并稀釋至1000mL。 

13 乙酸溶液(3%):量取冰乙酸3mL于100mL容量瓶中,以水稀釋至刻度,混勻。

標準溶液的配制：

亞硝酸鈉(NaNO2,CAS號:7632-00-0):基準試劑,或采用具有標準物質證書的亞硝酸鹽標準 溶液。

1 亞硝酸鈉標準溶液(200μg/mL,以亞硝酸鈉計):準確稱取0.1000g于110 ℃~120 ℃干燥恒 重的亞硝酸鈉,加水溶解,移入 500mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻。

2 亞硝酸鈉標準使用液(5.0μg/mL):臨用前,吸取2.50mL亞硝酸鈉標準溶液,置于100mL容 量瓶中,加水稀釋至刻度。

二、樣品預處理

1 乳粉、豆奶粉、嬰兒配方粉等固態(tài)乳制品(不包括干酪):將試樣裝入能夠容納2倍試樣體積的帶蓋容器中,通過反復搖晃和顛倒容器使樣品充分混勻直到使試樣均一化。 

2 發(fā)酵乳、乳、煉乳及其他液體乳制品:通過攪拌或反復搖晃和顛倒容器使試樣充分混勻。 

3 干酪:取適量的樣品研磨成均勻的泥漿狀。為避免水分損失,研磨過程中應避免產(chǎn)生過多的熱量。

沉淀蛋白質、去除脂肪，提取制備待測液：

1 干酪:稱取試樣2.5g(精確至0.001g),置于150mL具塞錐形瓶中,加水80mL,搖勻,超聲30min,取出放置至室溫,定量轉移至100mL容量瓶中,加入3%乙酸溶液2mL,加水稀釋至刻度,混勻。于4℃放置20min,取出放置至室溫,溶液經(jīng)濾紙過濾,濾液備用。

2 液體乳樣品:稱取試樣90g(精確至0.001g),置于250mL具塞錐形瓶中,加12.5mL飽和硼砂溶液,加入70 ℃左右的水約60mL,混勻,于沸水浴中加熱 15min,取出置冷水浴中冷卻,并放置至室溫。定量轉移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L 亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,再加入5mL220g/L乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質。加水至刻度,搖勻,放置30min,除去上層脂肪,上清液用濾紙過濾,濾液備用。 

3 乳粉:稱取試樣10g(精確至0.001g),置于150mL具塞錐形瓶中,加12.5mL50g/L飽和硼砂溶液,加入70℃左右的水約150mL,混勻,于沸水浴中加熱 15min,取出置冷水浴中冷卻,并放置至室溫。定量轉移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L 亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,再加入5mL220g/L乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質。加水至刻度,搖勻,放置30min,除去上層脂肪,上清液用濾紙過濾,棄去初濾液30mL,濾液備用。

三、標準曲線制作及亞硝酸鹽測定

吸取40.0mL 上述濾液于50mL 帶塞比色管中,另吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、 0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50 mL 亞硝酸鈉標準使用液(相當于0.0μg、1.0μg、2.0μg、 3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亞硝酸鈉),分別置于50mL 帶塞比色管中。

于標準管與試樣管中分別加入2mL4g/L對氨基苯磺酸溶液,混勻,靜置3min~5min后各加入1mL2g/L鹽酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混勻,靜置15min,用1cm比色杯,以零管調(diào)節(jié)零點,于波長538nm處測吸光度,繪制標準曲線比較。同時做試劑空白。

四、亞硝酸鹽含量計算

式中: 

X1 ——試樣中亞硝酸鈉的含量,單位為毫克每千克(mg/kg); 

m2 ——測定用樣液中亞硝酸鈉的質量,單位為微克(μg); 

1000——轉換系數(shù); 

m3 ——試樣質量,單位為克(g); 

V1 ——測定用樣液體積,單位為毫升(mL); 

V0 ——試樣處理液總體積,單位為毫升(mL)。 

五、 精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。此方法亞硝酸鹽檢出限:液體乳0.06mg/kg,乳粉0.5mg/kg,干酪及其他1mg/kg。結果保留2位有效數(shù)字。

六、注意事項

①樣品必須粉碎均勻，以便充分提??；

②顯色時，必須按順序添加對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺，不得顛倒順序；

③認真判定樣品的濾液是否澄清、透明、無干擾色；若有干擾色必須進行樣品空白扣除實驗；

④比色管和容量瓶等這些玻璃器材應該用稀鹽酸浸泡24小時，然后用蒸餾水沖洗干凈，然后倒扣在比色管架子上，控水，讓比色管自然晾干。

⑤用在紫外分光光度計上的比色皿應該處理干凈，處理的方法是浸泡在重鉻酸鉀溶液中，也可以浸泡在乙醇鹽酸溶液中，這樣處理比色皿就比較干凈了。

⑥紫外分光光度計應該做好暗電流校正，應該提前預熱半個小時才能使用，預熱的目的是讓機器更穩(wěn)定，數(shù)據(jù)更加的準確。

⑦在配制磺胺等各種溶液的時候，應該使用不含有亞硝酸鹽的蒸餾水，這樣能保證實驗的準確，能保證實驗更容易成功。

⑧在做標準曲線的時候，可以自己配制，也可以買現(xiàn)成的標準溶液，在移取的時候，可以用移液管或者是移液槍，但是要經(jīng)過檢驗合格，這是很重要的。

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