2.結(jié)果與討論

2.1儀器測定條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1檢測器的選擇

色氨酸由于其特殊結(jié)構(gòu)，既具有紫外吸收，又具有熒光響應(yīng)。為使色氨酸的檢測能夠獲得較高的靈敏度, 需要確定色氨酸的最大吸收波長和最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長。研究中首先通過二極管陣列檢測器（DAD）將色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長190~450 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果表明,在檢測波長280 nm處，色氨酸有明顯的特征吸收峰，且基質(zhì)干擾較少，故將吸收波長280 nm作為紫外檢測器檢測色氨酸的檢測波長。同時將最大吸收波長280 nm作為激發(fā)波長通過熒光檢測器對色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，觀察到色氨酸在波長346 nm處具有較高的靈敏度。因此,實驗最終確定熒光檢測器激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為346 nm。

經(jīng)大量樣本檢測表明，在相同流動相條件下，部分樣品的紫外色譜圖中在目標(biāo)物的保留時間處有難以分離的干擾峰，并影響到定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，故采用熒光檢測器進(jìn)行檢測和定量。樣品紫外檢測器譜圖和熒光檢測器譜圖見圖1。

2.1.2流動相的選擇

流動相比較了0.1%的乙酸溶液-甲醇和10 mmol/L 醋酸銨溶液（pH=4.0）-甲醇體系的洗脫情況，結(jié)果表明在0.1%的乙酸溶液條件下個別樣品中有明顯的干擾峰，且難以與目標(biāo)物有效分離，導(dǎo)致定量結(jié)果不夠準(zhǔn)確。而10 mmol/L 醋酸銨溶液（pH=4.0）條件下目標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)峰均可以與干擾峰（圖2，峰3）達(dá)到基線分離。譜圖見圖2。

a-甲醇-0.1%乙酸溶液b-甲醇-醋酸銨溶液

2.2試樣前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 堿的選擇

在樣品堿水解的過程中，考察不同的堿對水解結(jié)果的影響。方法研究中，選擇蛋白質(zhì)含量最高的乳粉基質(zhì)作為實驗對象，選取了相同濃度（4 mol/L）的LiOH、NaOH和KOH 3種堿溶液在相同試驗條件下進(jìn)行試驗，考察堿水解后色氨酸含量的變化，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，在相同的條件下，使用LiOH溶液處理的樣品中色氨酸含量最高，使用外標(biāo)法定量回收率83%，而NaOH溶液和KOH溶液對試樣中的色氨酸有不同程度的破壞，回收率只有76%和70%，故方法選定LiOH溶液作為水解過程中的堿溶液。

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