如圖2所示，當(dāng)牡蠣發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為4％時，氨基態(tài)氮的含量最高，但是蛋白質(zhì)含量未達到最低。接種量在繼續(xù)增加的同時，氨基態(tài)氮和蛋白質(zhì)二者的含量走向都呈現(xiàn)降低趨勢。這可能是因為在接種量過低時，納豆芽孢桿菌繁殖較慢，產(chǎn)酶過少；而當(dāng)菌種接種量過大時，菌種繁殖過快，密度過大，導(dǎo)致氧氣接觸不足，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物較少。而且牡蠣肉作為納豆芽孢桿菌繁殖代謝的主要營養(yǎng)基質(zhì)，其中豐富的蛋白質(zhì)被納豆芽孢桿菌自身分泌的蛋白酶分解成寡肽和氨基酸，使得發(fā)酵液中含有豐富的氨基態(tài)氮。而當(dāng)發(fā)酵液中小分子肽和氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量相差較多時，納豆芽孢桿菌會優(yōu)先消耗小分子物質(zhì)，從而導(dǎo)致當(dāng)接種量過多時蛋白質(zhì)與氨基態(tài)氮的含量均隨之逐漸降低。表明在接種量2％～6％之間時，氨基態(tài)氮處于含量最高期。

如圖3所示，當(dāng)接種量固定為4％時，發(fā)酵時間在12h～48h范圍內(nèi)，氨基態(tài)氮的含量在不斷增加，在發(fā)酵時間為48～60h時稍有下降，可能是由于納豆芽孢桿菌消耗蛋白質(zhì)的同時開始利用小分子的氨基酸導(dǎo)致，也有可能是因為蛋白酶活力在發(fā)酵48h時達到最大，發(fā)酵時間是影響納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶的重要因素，在產(chǎn)酶總量達到最大值之后繼續(xù)發(fā)酵可能會導(dǎo)致蛋白酶酶活下降。在12h～60h期間，蛋白質(zhì)的含量在不斷下降。在36h～48h期間氨基態(tài)氮含量與蛋白質(zhì)含量的變化趨緩，此時的納豆芽孢桿菌在水解蛋白質(zhì)和消耗氨基酸的過程中處于平衡期。納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶最高值后應(yīng)立即停止發(fā)酵，否則酶活力會出現(xiàn)回落現(xiàn)象。因此，在固定條件接種量為4％和發(fā)酵時間48h下進行后續(xù)試驗。

2、正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

在固定料液比l:4(g／mL)，發(fā)酵溫度37℃和葡萄糖添加量2％的基礎(chǔ)上，對單因素試驗的數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析并選取合適的發(fā)酵條件范圍，以發(fā)酵pH、接種量、發(fā)酵時間為主要因素，并以測定的氨基態(tài)氮含量作為參考，進行三因素三水平L₉(3³)正交優(yōu)化試驗，具體試驗方案和結(jié)果見表1。

由表1分析可知，以氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，各因素的影響依次為A＞B＞C，即接種量對氨基態(tài)氮含量的影響最大，其次是發(fā)酵時間，發(fā)酵pH對氨基態(tài)氮含量的影響最小。由正交試驗結(jié)果分析確定最佳優(yōu)化工藝條件：A₃B₃C₂，即發(fā)酵pH為7，接種量為6％，發(fā)酵時間為48h。

由表2方差分析可知，此次試驗的三個因素中，接種量對氨基態(tài)氮含量具有顯著性影響(P＜0．05)，發(fā)酵時間和發(fā)酵pH對試驗結(jié)果無顯著性影響(P＞0.05)。

3、驗證試驗

為驗證正交試驗所得結(jié)果的可靠性，在上述最佳發(fā)酵工藝條件下進行三次平行試驗并測定發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量。經(jīng)測定，所得發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量為0．785mg／mL，與正交試驗結(jié)果接近，證實試驗結(jié)果可靠。

三、結(jié)論

本試驗以低價購買市場淘汰的牡蠣廢料作為發(fā)酵主要原料，用納豆芽孢桿菌對其進行發(fā)酵，可以提高牡蠣的利用價值。固定料液比1:4，發(fā)酵溫度37℃和葡萄糖添加量2％，通過單因素試驗選取適宜發(fā)酵條件范圍：發(fā)酵pH為6～8，接種量為2％～6％，發(fā)酵時間為24h～48h。在此基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計優(yōu)化試驗確定納豆芽孢桿菌發(fā)酵牡蠣的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵pH7，接種量6％，發(fā)酵時間48h，此時發(fā)酵液中氨基態(tài)氮的含量達到0．791mg／mL。

本試驗的發(fā)酵結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌可以用于牡蠣的發(fā)酵，為水產(chǎn)動物的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，為蛋白高值化提供了依據(jù)，同時為水產(chǎn)品的開發(fā)提供新的方向，充分利用市場淘汰的牡蠣邊角料。而且，發(fā)酵水解液氨基態(tài)氮含量豐富，水解液經(jīng)過濃縮提取也可以制備氨基酸口服液、氨基酸含片、氨基酸護膚品、氨基酸添加劑等，本研究為氨基酸產(chǎn)品的制備提供了依據(jù)。

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