為建立一種以水合茚三酮為顯色劑準確定量檢測γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)的方法，本文系統(tǒng)研究了顯色酸度、顯色劑用量、加熱溫度和時間等顯色條件對水合茚三酮與GABA顯色反應的影響，并在最優(yōu)條件下對該方法進行了評價。結果表明，在pH=7.0時，GABA與1.8 g·L^-1茚三酮乙醇溶液沸水浴60 min后顯色穩(wěn)定。顯色后在567 nm處的吸光度與GABA的濃度線性關系良好(y=0.01234x-0.00113，R2=0.99983)。該方法重現性好(RSD=0.06%)，準確度較高(加標回收率為95.4%～117.6%)，檢出限達21.6μg·L^-1，對GABA有一定的選擇性。對食品添加劑中的GABA用薄層色譜分離后進行顯色測定，結果滿意。

近年來，隨著孤獨癥、抑郁癥、精神分裂癥等精神類疾病對生命健康和幸福指數的威脅逐漸增長，有關精神類疾病的預防、診療和致病機理的研究受到日益廣泛的關注。精神類疾病致病原因復雜，但大多數中樞神經類疾病都與神經遞質濃度的變化相關。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)是哺乳動物體內一種重要的抑制類神經遞質，主要存在于大腦皮質、海馬、丘腦、基底神經節(jié)和小腦中，介導了40%以上的中樞神經抑制性信號。GABA作為一種重要的藥食同源的非蛋白質氨基酸，具有延緩大腦衰老、降低血壓、增強免疫力、活化肝腎、增強記憶力和抗焦慮等功效。研究表明GABA對抑郁癥、孤獨癥、精神分裂癥、腦血管病引起的偏癱、記憶障礙、兒童智力發(fā)育遲緩等多種疾病均有不同程度的療效，具有很好的應用前景。目前市場上已出現多種添加或號稱富含GABA的保健食品和藥品。因此，發(fā)展一種簡便快捷的測量方法準確測定GABA含量具有重要意義。

目前GABA的定量分析常用(超)高效液相色譜法、電泳法和紙層析法、氨基酸自動分析儀法等。因GABA自身在可見區(qū)和近紫外區(qū)都無明顯吸收，測定時多是基于GABA與其他試劑反應生成的衍生物的光吸收進行測定。常用衍生化試劑主要有苯二醛-2-巰基乙醇、丹磺酰氯以及鄰苯二甲醛和水合茚三酮等。其中水合茚三酮因反應產物顏色明顯，在可見區(qū)即可測定，對儀器的要求低，應用較廣。雖已有關于水合茚三酮顯色法測定氨基酸的報道，但不同文獻報道的測定條件不盡相同，且水合茚三酮與結構不同的氨基酸的顯色反應也存在差異。因此本文針對GABA，研究了各種因素對其與水合茚三酮顯色反應的影響，確定了最佳測定條件，并考察了該方法的重現性、準確度、選擇性等分析性能，并結合薄層色譜實現了食品添加劑中GABA的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

PH-10/100 酸度計(上海越平科學儀器);PE Lambda 35紫外可見分光光度計(Perkin-Elmer Co.，Wellesley， MA， USA);HH-2型數顯恒溫水浴鍋(國華電器);FA 1204C型電子分析天平(上海越平科學儀器)。

GABA(批號：H1829037)，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；水合茚三酮(批號：20200507)、乙醇(批號：20200612)、磷酸(批號：20190715)、可溶性淀粉、聚乙二醇、二氧化鈰、氯化亞錫、Fe2(SO4)3·xH2O、FeCl2·4H2O、Na2SO4，以上試劑均為分析純，購自國藥集團。玉米淀粉發(fā)酵提取的含GABA的食品添加劑，購自浙江益萬生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最佳測量波長的選擇

在10 mL比色管中加入2 mL 64 g·L^-1 GABA(或水)、2 mL 0.3 mol·L^-1 pH=5.0的磷酸緩沖溶液和1 mL 3.2 g·L^-1的水合茚三酮溶液(用水或乙醇溶解)，混合均勻后，沸水浴20 min， 冷卻至室溫后，用水定容至5 mL，用紫外可見分光光度計分別測其吸收光譜，比較水溶和醇溶的區(qū)別，并確定適宜的測定波長。

1.2.2 顯色條件的影響和選擇

本文采用單變量比較法分別研究酸度、顯色劑用量、顯色溫度和加熱時間對顯色測定的影響。具體來說，在10 mL比色管中依次加入1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液、1 mL不同pH的磷酸緩沖溶液(0.3 mol·L^-1)和2 mL不同濃度的水合茚三酮乙醇溶液，用水定容至5 mL，混勻并水浴加熱一定時間后，冷卻至室溫，定容至5 mL，混勻后測其吸收光譜，并比較不同條件下顯色后溶液在選定波長的吸光度。

1.2.3 茚三酮顯色法測定GABA的性能評價

探究酸度、顯色劑用量、溫度和加熱時間等因素對顯色的影響后，在最佳顯色條件下分別對水合茚三酮顯色測定GABA的工作曲線、重現性和抗干擾能力等進行了考察。

干擾物的選擇主要是樣品中可能存在的共存組分和根據顯色原理可能會干擾的一些物質。將40 mg·L^-1的GABA溶液及相同濃度GABA但加有不同干擾物的混合液(1.5 g·L^-1淀粉、15 mg·L^-1聚乙二醇、45 mg·L^-1 Fe3+、30 mg·L^-1 Fe2+、15 mg·L^-1氯化亞錫和15 mg·L^-1二氧化鈰)分別在最佳條件下顯色測定，并比較加入干擾物對溶液吸光度的影響，考察水合茚三酮顯色法測定GABA的抗干擾能力。

1.2.4 薄層色譜分離與實際樣品檢測

為避免實際樣品中可能存在的其他氨基酸或蛋白質對測定結果的影響，在進行光度測定前進行了薄層色譜分離。薄層色譜條件為：高效硅膠薄層板(50 mm×200 mm， 100℃下活化1 h)，點樣3 μL，展開劑為正丁醇、冰乙酸、水混合液(4∶2.2∶1，V/V)，顯色方法：以2%的茚三酮乙醇溶液為顯色劑，噴灑后在烘箱中100℃加熱顯色至斑點清晰。

將薄層色譜分離后的GABA斑點取下溶解，在選定條件下，利用水合茚三酮對市售食品添加劑中GABA進行測定，并通過三個不同濃度的加標回收及與其他氨基酸的分離實驗評價該方法的準確度。

2 結果與討論

2.1 水合茚三酮溶劑的選擇與最佳測量波長的確定

文獻報道中，常以水或乙醇為溶劑溶解水合茚三酮作為顯色劑來檢測游離氨基酸，故本文首先對比用水和乙醇分別溶解水合茚三酮對GABA測定的區(qū)別。在相同濃度下以對應試劑空白為參比得到的結果如圖1所示。水溶的水合茚三酮與GABA沸水浴后和水溶的水合茚三酮溶液自身沸水浴后在可見區(qū)內均無明顯吸收峰，而乙醇溶解的水合茚三酮與GABA沸水浴后在420 nm和567 nm有明顯吸收峰，故用乙醇溶解水合茚三酮較好。此外，因在420 nm處的吸收峰與水合茚三酮乙醇溶液自身沸水浴后在357 nm處的吸收峰有重合，為避免干擾，選擇567 nm作為測量波長最佳。

2.2 顯色條件的影響

顯色條件對于GABA定量轉化成有色吸光物質至關重要。本文采用單變量比較法分別研究了酸度、顯色劑用量、顯色溫度和加熱顯色時間對顯色測定的影響，具體分別討論如下。

2.2.1 酸度的影響

文獻報道的茚三酮顯色法測定氨基酸的酸度條件差別較大，為探究茚三酮顯色測定GABA的最佳酸度，將1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液和2 mL 1.6 g·L^-1水合茚三酮乙醇溶液，分別在不同pH下沸水浴20 min， 冷卻后，定容混勻并測567 nm處的吸光度，結果如圖 2 a所示。在pH=3.0和4.0時，水合茚三酮乙醇溶液與GABA沸水浴后測得吸光度幾乎為零，故此酸度不適宜顯色。當pH大于4.0時，水合茚三酮與GABA的顯色反應正常進行，吸光度隨pH的升高逐漸升高，并在pH=7.0時達到峰值，隨后呈明顯下降趨勢。這說明水合茚三酮與GABA的顯色反應需在適宜酸度范圍內進行，pH=7.0為最佳顯色酸度。

2.2.2 顯色劑用量的影響

為探究顯色劑用量的影響，在確定最佳顯色酸度的基礎上(pH=7)將1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液分別和2 mL不同濃度的水合茚三酮乙醇溶液沸水浴20 min， 冷卻至室溫后定容，測567 nm處的吸光度。結果如圖 2 b 所示。在水合茚三酮濃度為0.4～1.6 g·L^-1時，顯色后吸光度隨水合茚三酮濃度的增加呈明顯增加趨勢。當水合茚三酮濃度在1.6～3.2 g·L^-1時，吸光度變化較小。本文后續(xù)均采用1.8 g·L^-1的水合茚三酮乙醇溶液進行顯色。

2.2.3 顯色溫度的影響

加熱可加速反應的進行，但溫度太高也會影響試劑的穩(wěn)定性。將1 mL 64 mg·L^-1的 GABA水溶液、1 mL pH=7磷酸緩沖溶液和2 mL 1.8 g·L^-1的水合茚三酮乙醇溶液混勻后定容至5 mL，然后分別在不同溫度下水浴加熱30 min， 冷卻后再用水定容至5 mL搖勻，測567 nm處的吸光度。結果(圖2 c)表明：在40～70℃水浴加熱30 min， 吸光度幾乎為0，說明水合茚三酮與GABA基本沒發(fā)生顯色反應，無法測定；當加熱溫度為85℃時，吸光度增大，水合茚三酮與GABA部分顯色，但反應不完全；當水浴溫度升高至100℃時，吸光度急劇增大，水合茚三酮與GABA的顯色反應程度顯著增高；溫度繼續(xù)增高會影響茚三酮的穩(wěn)定性，故確定100℃為最佳顯色溫度。

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