1.4 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

碳酸氫鈉、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、氯化鋁、醋酸鉀[成都市科隆化學(xué)品有限公司]，氯乙酰膽堿[成都華夏化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)成都）]，蓖麻油（河南省華龍藥業(yè)有限公司），維拉帕米[Medchemexpress有限公司（美國(guó)）]，洛哌丁胺[西格瑪化學(xué)公司（美國(guó)圣路易斯）]，色譜乙腈（成都市科隆化學(xué)品有限公司），純化水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），鹽酸[成都市科隆化學(xué)品有限公司]、氯化鐵、甲醇（重慶騰華化工有限公司）、醋酸鉀和氯化鋁用于粗提物的植物化學(xué)分析。蒸餾水（四川優(yōu)普超純科技有限公司）用于制備標(biāo)準(zhǔn)溶液、稀釋液和生理鹽溶液（Tyrode溶液）。

1.5儀器

家兔類通用實(shí)驗(yàn)器械，HW-400E恒溫平滑肌槽（四川成都泰盟公司），BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（四川成都泰盟公司），F(xiàn)T-100生物張力傳感器（四川成都泰盟軟件有限公司），優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司），HH600-2B三用恒溫水浴箱（金壇市科析儀器有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（YDYQ,101-2A），粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)W177），電子分析天平（Mettle AE 240），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA），真空減壓干燥箱（武漢奧普森試驗(yàn)設(shè)備有限公司，ZK 6050B）。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取110只健康昆明雌雄小鼠（18～22 g）以及42只健康家兔（2.0～2.5 kg），由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供[許可證編號(hào)：SYXK(chuan)2013-076]，小鼠和家兔飼養(yǎng)于23～26℃、濕度適宜的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，12 h光照黑暗循環(huán)，期間可自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)符合中國(guó)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的管理，并遵循動(dòng)物倫理和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則。

1.7 實(shí)驗(yàn)方法

1.7.1 FS ext的急性毒性

取60只禁食4 h（可自由飲水）的小鼠隨機(jī)分為0.5 g/kg FS ext試驗(yàn)組、1.0 g/kg FS ext試驗(yàn)組、2.0 g/kg FS ext試驗(yàn)組、4.0 g/kg FS ext試驗(yàn)組、8.0 g/kg FS ext試驗(yàn)組、16.0 g/kg FS ext試驗(yàn)組，每組10只，分別給予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0g/kg、16.0 g/kg的FS ext進(jìn)行灌胃，處理后的小鼠可自由飲水進(jìn)食，記錄14 d內(nèi)小鼠的死亡情況和毒性跡象，建立相應(yīng)的劑量-效應(yīng)曲線，從而確定FS ext的半數(shù)致死劑量（LD50），以確定其安全性[9]。

1.7.2 對(duì)蓖麻油性腹瀉的影響

另取50只小鼠隨機(jī)分成陰性組、陽(yáng)性組、0.25 g/kg FS ext試驗(yàn)組、0.50 g/kg FS ext試驗(yàn)組、1.00 g/kg FS ext試驗(yàn)組，每組10只，陰性組給予0.9%氯化鈉溶液（20 ml/kg）灌胃，陽(yáng)性組給予洛哌丁胺（4 mg/kg）灌胃，0.25 g/kg FS ext試驗(yàn)組、0.50g/kg FS ext試驗(yàn)組、1.00 g/kg FS ext試驗(yàn)組分別給予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。給藥30 min后，小鼠均給予蓖麻油0.4 ml灌胃，然后將每只小鼠放入單獨(dú)的籠子中，地板襯有吸墨紙，將線網(wǎng)放置在離底部3 cm的籠中以使小鼠與吸墨紙隔開。觀察4 h內(nèi)以下指標(biāo)：初始半固體糞便時(shí)間，固體、半固體、液體糞便數(shù)量。采用腹瀉指數(shù)（EI）評(píng)估腹瀉的嚴(yán)重程度。EI=固體糞便數(shù)量×1+半固體糞便數(shù)量×2+液體糞便數(shù)量×3。

1.7.3 離體標(biāo)本制備

選取健康家兔，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。用木槌擊致頭昏，解剖家兔，以胃幽門與十二指腸交界處為起始部，取空腸并立即放入通有95%O2和5%CO2混合氣的臺(tái)氏液中，將內(nèi)容物沖洗干凈并剪去腸系膜，剪成1.5～2.0 cm數(shù)段，一端用線結(jié)扎固定于通氣溝，另一端固定于張力換能器。給予前負(fù)荷1 g，浴槽內(nèi)溫度維持在（37.0±0.5）℃，通氣溝以每秒1～2個(gè)氣泡的速度持續(xù)通入混合氣，待基線穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。

1.7.4 FS ext對(duì)家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響

待空腸平滑肌張力穩(wěn)定后，單劑量加入FS ext(0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，這些濃度是累加所得，即后一個(gè)的濃度由前一個(gè)濃度累加，主要目的是為了觀察家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮隨FS ext的濃度變化而變化的趨勢(shì)），以給藥前的張力為100%，記錄給藥后空腸平滑肌自發(fā)性收縮的張力變化。按照上述方法，用維拉帕米（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00μmol/L）處理家兔離體空腸平滑肌作為對(duì)照，記錄給予維拉帕米后家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的張力變化。

1.7.5 FS ext對(duì)由乙酰膽堿（ACh）和KCl誘導(dǎo)的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響

待空腸平滑肌張力穩(wěn)定后，分別加入ACh(10μmol/L）和KCl(60mmol/L）預(yù)處理，出現(xiàn)最大波峰后，立即用臺(tái)氏液沖洗腸管，等其穩(wěn)定后，再次分別加入ACh(10μmol/L）和KCl(60μmol/L),15 min后，加入FS ext使其終濃度分別達(dá)0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00mg/ml，并記錄空腸平滑肌自發(fā)性收縮穩(wěn)定時(shí)的張力變化。按照上述方法，用維拉帕米（0.001、0.010、0.100、1.000、3.000μmol/L）處理家兔離體空腸作為對(duì)照，重復(fù)上述步驟，并記錄此時(shí)空腸平滑肌自發(fā)性收縮穩(wěn)定時(shí)的張力變化。

1.7.6 FS ext對(duì)由CaCl2誘導(dǎo)的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響

為確定FS ext對(duì)Ca2+內(nèi)流的影響，首先讓腸管處于Tyrode溶液中，待其張力穩(wěn)定后，將Tyrode溶液換為含EDTA的無(wú)Ca2+高K+溶液，持續(xù)30 min以從組織中除去Ca2+。再將溶液換為不含EDTA的無(wú)Ca2+高K+溶液，持續(xù)15 min，然后再加入FS ext(0.3、1.0 mg/ml），構(gòu)建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效曲線，觀察給予不同劑量FS ext后家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮率的變化。在加入維拉帕米（1μmol/L）的情況下，構(gòu)建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效關(guān)系曲線，觀察空腸平滑肌自發(fā)性收縮率變化。在沒有FS ext和維拉帕米預(yù)處理的情況下，將3×10-2 mol/L CaCl2誘導(dǎo)的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮率認(rèn)為是100%[12]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 植物化學(xué)分析

2.1.1 初步植物化學(xué)分析

對(duì)FS ext的初步植物化學(xué)分析表明其含有酚類、皂苷類和黃酮類化合物。

2.1.2 總黃酮的含量

FS ext中黃酮含量的測(cè)定表明，黃酮含量為8.13 mg/g。

2.1.3 高效液相色譜法檢測(cè)FS ext中的化學(xué)成分

采用高效液相色譜法對(duì)FS ext中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，F(xiàn)S ext中主要含連翹苷和連翹酯苷A。在上述1.3.3的色譜條件下，連翹苷和連翹酯苷A的分離度良好，空白、混合標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的色譜圖見圖1。

2.2 FS ext的急性毒性

在測(cè)量LD50的實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠按不同劑量的FS ext進(jìn)行灌胃后，在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何死亡或毒性跡象。單次給予FS ext的劑量為16g/kg，小鼠在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何的死亡及行為變化。

2.3 FS ext對(duì)小鼠蓖麻油性腹瀉的影響

5組初始半固體糞便時(shí)間和EI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。陽(yáng)性組初始半固體糞便時(shí)間長(zhǎng)于陰性組、0.25 g/kg FS ext試驗(yàn)組、0.50 g/kg FS ext試驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05);1.00 g/kg FS ext試驗(yàn)組初始半固體糞便時(shí)間長(zhǎng)于陰性組、0.25 g/kg FS ext試驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。陰性組EI高于陽(yáng)性組、1.00 g/kg FS ext試驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05);0.25 g/kg FS ext試驗(yàn)組、0.50 g/kg FS ext試驗(yàn)組EI高于陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，見表2）。

2.4 FS ext對(duì)家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響

臺(tái)氏液對(duì)家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，見圖2）。FS ext對(duì)家兔離體空腸平滑肌表現(xiàn)出劑量依賴性解痙作用，即半最大效應(yīng)濃度（EC50)=1.21 mg/ml(1.11～1.26mg/ml,n=6），見圖3。圖形類似于維拉帕米（0.01～10μmol/L），其EC50為0.51μmol/L(0.42～0.59μmol/L,n=6），見圖4。

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