2.3高壓制備方法的確定

初始方法為魯南新時(shí)代生物技術(shù)有限公司在50mm高壓制備液相(漢邦科技，制備型液相色譜系統(tǒng)，NS4000)上開(kāi)發(fā)，是以二氯甲烷、甲醇和水體系制備紐莫康定B₀，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)具體報(bào)道。張宇等采用了氯仿、甲醇和水體系，筆者以二氯甲烷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，毒性低于氯仿，價(jià)格也低于氯仿，放大生產(chǎn)具有一定的優(yōu)越性。初始方法：將紐莫康定B₀粗品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.2%，HPLC檢測(cè)如圖1所示，紐莫康定B₀的色譜純度為88.58%、紐莫康定C₀的色譜純度為8.78%)用甲醇、二氯甲烷混合溶液(V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶4)溶解，波長(zhǎng)276nm；柱溫20～30℃；流量70mL/min；上樣量1.7g；流動(dòng)相，V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=43∶9∶1；操作壓力5～5.5MPa。收集B₀的HPLC色譜純度>95%的制備液。紐莫康定B₀的色譜純度值和紐莫康定C₀的色譜純度值是經(jīng)過(guò)面積歸一化法得到的。以線性原則放大到中試150mm制備柱(Cs-prep150工業(yè)制備色譜系統(tǒng)，漢邦科技)，流量調(diào)整為630mL/min；進(jìn)樣量15.3g；其他不變。在此基礎(chǔ)上，對(duì)該方法進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.1流動(dòng)相比例的優(yōu)化

根據(jù)正相色譜特點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控二氯甲烷，對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化。在初始方法中，實(shí)驗(yàn)分析了V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)的5個(gè)比例對(duì)紐莫康定B₀制備分離的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2可知：隨著二氯甲烷比例的增加，紐莫康定B₀峰的保留時(shí)間逐漸增加，B₀峰分離度逐漸增大，B₀峰和相鄰峰的重合越小。其中，41∶9∶1和42∶9∶1的流動(dòng)相比例相比，后者B₀分離度高于前者，且B₀峰型較好，保留時(shí)間相差不大。保留時(shí)間越長(zhǎng)，生產(chǎn)成本越大。綜合考慮B₀的分離效果和生產(chǎn)成本，故選擇V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1。

2.3.2上樣量的優(yōu)化

上樣量在色譜制備中影響著目的峰的分離度及制備效率。因此，在流動(dòng)相比例確定為V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)選取了3種進(jìn)樣量(7.5，11.4，15.3g)對(duì)紐莫康定B₀制備的效果進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

上樣量越大，分離度越小。對(duì)不同上樣量下的B0峰進(jìn)行分段收集，并對(duì)B0的HPLC色譜純度大于95%的料液進(jìn)行合并、減壓濃縮和凍干，得到凍干粉的質(zhì)量分別為3.01，4.7，4.8g。3種凍干粉B₀質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95.73%，95.77%，95.63%，相差不大。計(jì)算收率分別為47.31%，48.63%，36.95%，其表達(dá)式為

式中：X為上樣液對(duì)應(yīng)粗品質(zhì)量；Y為粗品B0質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

由表3可知：上樣量11.4g收率高于上樣量7.5，15.3g。收率高，則在中試、大生產(chǎn)中預(yù)示著低成本、高效益，以及制藥企業(yè)在市場(chǎng)中較高的競(jìng)爭(zhēng)力。因此，綜合考慮對(duì)紐莫康定B₀的分離效果和收率，選擇11.4g上樣量。

2.3.3洗脫流速的優(yōu)化

在高壓制備液相色譜中，洗脫流速影響柱壓、峰型，進(jìn)而影響到制備效率及效果。故在確定流動(dòng)相比例V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1及上樣量11.4g的基礎(chǔ)上，考察了5個(gè)洗脫流速(480，530，580，630，680mL/min)對(duì)紐莫康定B₀制備的影響，結(jié)果如表4所示。

由表4知：洗脫流速越大，柱壓越高，峰型越窄。對(duì)不同洗脫流速下的B₀峰進(jìn)行分段收集，并對(duì)B₀的HPLC色譜純度大于95%的料液進(jìn)行合并、減壓濃縮和凍干。流速越大，得到的洗脫合并液體積逐漸減小，且減小幅度不大。最終得到的凍干粉質(zhì)量分別為4.71，4.70，4.72，4.73，4.72g，其各數(shù)值相差很小。

隨著流速的增加，柱壓逐漸增加，而實(shí)驗(yàn)所用150mm高壓制備系統(tǒng)工作壓力為0～7MPa。隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加，柱壓會(huì)逐漸增高，再生柱子會(huì)越頻繁，如此會(huì)占用一定的工時(shí)和消耗再生溶劑，增加生產(chǎn)成本。另外，在5個(gè)流速下，凍干粉的收率和B0質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大。綜上考慮，優(yōu)選480mL/min的流速作為150mm的制備柱流速。

2.4紐莫康定B0的高壓色譜制備

以優(yōu)化后的高壓制備條件，在150mm制備柱上進(jìn)行紐莫康定B₀的制備。對(duì)B₀峰分段收集，連續(xù)進(jìn)樣，合并紐莫康定B₀的HPLC色譜純度大于95%的制備液。將合并液進(jìn)行減壓濃縮，凍干，得到紐莫康定B₀凍干粉。

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