2.4.4 線性關(guān)系考察

用70%甲醇對(duì)貯備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，得到2.024、20.240、50.600、101.200、151.800μg/m L的系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取溶液各10μL，注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=35.919 X-4.386 4,r=1.000 0，結(jié)果表明，MMQ在2.024～151.800μg/m L線性關(guān)系良好。

2.4.5 定量限和檢測(cè)限

取對(duì)照品貯備溶液，逐步稀釋，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，信噪比（S/N）為10∶1，測(cè)得MMQ的定量限約為2.024μg/m L。信噪比（S/N）為3∶1時(shí)，MMQ的檢測(cè)限約為0.607μg/m L。

2.4.6 精密度試驗(yàn)

選取高、中、低（101.200、50.600、20.240μg/m L)3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件下同1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得MMQ峰面積的RSD分別為0.73%、0.95%、1.37%。連續(xù)測(cè)定3 d，每天進(jìn)樣1次，記錄MMQ峰面積，測(cè)得MMQ峰面積的RSD分別為2.06%、1.61%、1.88%。結(jié)果顯示日內(nèi)、日間精密度均小于3%。表明日內(nèi)、日間精密度良好，儀器穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品粉末0.25 g(S5），按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，記錄MMQ的峰面積。采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算MMQ的含量，樣品中MMQ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.28 mg/g,RSD為1.37%，表明此方法重復(fù)性好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品粉末0.25 g(S5），按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，結(jié)果顯示MMQ峰面積的RSD為1.81%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的EGT粉末0.125 g(S5）精密稱定，按已測(cè)定的50%、100%、150%精密加入對(duì)照品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算加樣回收率。結(jié)果MMQ的平均加樣回收率為101.5%,RSD為1.46%。

2.4.1 0 定量測(cè)定

取7批EGT樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，經(jīng)HPLC測(cè)定后，結(jié)果顯示7批EGT(S8、S9因采集時(shí)間較久，未測(cè)定）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在0.13%～0.53%，見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

EGT為蒙古族習(xí)用藥材，目前無(wú)相關(guān)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以及專屬性成分的研究，本研究通過(guò)MCI色譜、硅膠色譜、高效液相色譜等分離手段，得到專屬性成分，經(jīng)核磁鑒定為一種喹啉酮類生物堿（MMQ）。本實(shí)驗(yàn)將EGT與其它4種近源樣品：大藍(lán)刺頭、硬葉藍(lán)刺頭、全緣藍(lán)刺頭和藍(lán)刺頭，進(jìn)行薄層色譜和HPLC檢測(cè)比較，結(jié)果顯示大藍(lán)刺頭、硬葉藍(lán)刺頭、全緣藍(lán)刺頭不含有MMQ，在藍(lán)刺頭樣品中雖含有少量MMQ，但遠(yuǎn)低于其檢測(cè)線。因此MMQ作為砂藍(lán)刺頭中含量較高且專屬性較強(qiáng)的成分，建立以其為指標(biāo)成分定性定量方法，有一定的科學(xué)性與實(shí)用性，可以更好地評(píng)價(jià)EGT藥材的質(zhì)量。

3.2 薄層色譜鑒別

在薄層鑒別展開(kāi)劑的考察中，發(fā)現(xiàn)酸對(duì)于薄層展開(kāi)體系的影響較大，非酸體系下，斑點(diǎn)較少、分離度較差。篩選了多種顯色劑，包括磷鉬酸、碘化鉍鉀、碘、10%硫酸乙醇等，顯色效果均不佳，不顯色或者顯色不靈敏，最終定為以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（6∶1∶1∶0.8）為展開(kāi)劑，254 nm紫外燈下檢視熒光斑點(diǎn)即可。比較了不同廠家的薄層板：銀龍-HSGF254板、黃海-HSGF254板、德國(guó)MNSGF板和德國(guó)MNHSGF板，所建立的薄層方法在上述幾種板中均能獲得很好的展開(kāi)效果，其中以德國(guó)MNHSGF板分離效果最好。

3.3 指紋圖譜建立

中藥色譜指紋圖譜能夠較為全面地反映中藥的整體質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)建立指紋圖譜分析方法能很好地將EGT與同屬其他植物相區(qū)別。相似度分析評(píng)價(jià)中，S9（批號(hào)20120815）相似度僅為0.679，其他EGT樣品相似度均高于0.9，這提示EGT樣品陳置過(guò)久可能會(huì)影響其藥材質(zhì)量。這一發(fā)現(xiàn)為藥材市場(chǎng)中EGT藥材年限控制提供數(shù)據(jù)參考。不同來(lái)源的9批樣品指紋圖譜中的共有峰在數(shù)目以及相對(duì)保留時(shí)間上保持一致，但各共有峰相對(duì)峰面積有一定的差異，說(shuō)明各批次藥材之間的質(zhì)量存在差異，推測(cè)可能與藥材產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收期等因素有關(guān)。將EGT和其他種藍(lán)刺頭的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主成分分析和聚類分析結(jié)果一致，均能實(shí)現(xiàn)EGT與同屬其他植物（藍(lán)刺頭、全緣葉藍(lán)刺、硬葉藍(lán)刺頭和大藍(lán)刺頭）的區(qū)別。在PCA中，16批樣品聚為2大類，S1～S9號(hào)樣品為不同批次EGT,S10～16號(hào)樣品為藍(lán)刺頭屬其他種樣品，其中S8和S9號(hào)樣品為2012年收集的樣品，雖經(jīng)放置多年，成分有所下降，但仍歸為EGT中。在聚類分析中，S8和S9號(hào)樣品處于同一組中；S14和S15號(hào)樣品為全緣藍(lán)刺頭也在同一組中，該結(jié)果與OPLS-DA結(jié)果一致。

3.4 含量測(cè)定

在建立MMQ的定量分析方法實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行了提取方法（超聲、加熱回流）、提取溶劑（純甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、提取時(shí)間和提取次數(shù)的考察。最終確定的提取方便操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，對(duì)砂藍(lán)刺頭中MMQ提取率高?？疾炝艘译?水、乙腈-醋酸銨緩沖鹽水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流動(dòng)相體系對(duì)液相色譜分離效果的影響。最終確定的含測(cè)方法重復(fù)性好，MMQ的分離度和含量測(cè)定RSD均符合檢測(cè)要求。另外，由于S8和S9藥材采集時(shí)間過(guò)久，為了不影響含量限度制定的準(zhǔn)確性，未對(duì)這2批藥材進(jìn)行含量測(cè)定。

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