①模擬的建立及其顯著性檢驗對表2的試驗數(shù)據(jù)進行二次模擬回歸分析，得到三萜化合物得率（Y）對料液比（A）、回流時間（B）和溫度（C）的二次多項回歸方程：Y=0.67＋6.000×10^-3A-8.525×10^-3B-6.150×10^-3C-0.020AB-2.700×10-3AC-8.900×10-3BC0.056A²-0.079B²-0.031C²。其分析結(jié)果見表3。

由表3可知，模型p＜0.0001，說明試驗選用的二次多項模型差異極顯著。失擬項p＞0.05，表示不顯著，即該模型對本實驗的擬合程度良好，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系。其中R²=0.9932，表明自變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，調(diào)整系數(shù)R²_Adj=0.9845，說明該模型能夠解釋98.45%的響應(yīng)值變化，試驗誤差小，可以運用此模型對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取工藝進行分析和預(yù)測。一次項A、B、C對響應(yīng)值三萜得率的影響達到顯著水平，二次項A²、B²、C²對其影響極顯著，AB、BC交互作用顯著說明不同提取條件與靈芝發(fā)酵粉三萜提取得率之間不是簡單的線性關(guān)系。

②響應(yīng)面交互作用分析

為確定各因素交互作用對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取得率的影響，根據(jù)二次模擬回歸方程繪出響應(yīng)面及等高線圖，見圖7至圖9。

圖7、圖9等高線形狀為橢圓形，而圖8等高線形狀為圓形，表明料液比和回流時間、回流時間和回流溫度的交互作用顯著，料液比和回流溫度的交互作用不顯著。

③最佳提取條件確定

通過回歸方程求得優(yōu)化后的三萜化合物提取條件為：料液比1∶30.66（g/mL）、回流時間2.94h，回流溫度84.53℃。為方便試驗操作，調(diào)整條件為料液比1∶30（g/mL）、回流時間3h、回流溫度85℃。驗證試驗測得三萜類化合物的平均得率為0.6760mg/g，與預(yù)測值0.6694mg/g相比誤差為0.98%，可見，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的三萜化合物的提取條件比較可靠。

2、靈芝三萜粗提物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

（1）靈芝三萜的高效液相色譜檢測

靈芝三萜粗提物經(jīng)二次柱層析分部收集后，合并單一斑點的流分進行高效液相色譜檢測，結(jié)果見圖10。

由圖10可以看出，流動相為2%乙酸溶液∶乙睛=70∶30時，檢測出樣品中有2個峰，說明樣品中有2個不同組分，分別保留時間4.039min、4.234min。

（2）紫外光譜掃描分析

由圖11可知，該物質(zhì)紫外譜圖在280nm、260nm波長處無明顯吸收峰，說明經(jīng)過前期硅膠柱層析后得到的三萜類化合物比較純，基本不含有蛋白質(zhì)及核酸等雜質(zhì)。其最大吸值在波長237nm處，具有靈芝三萜的特征吸收峰。根據(jù)規(guī)律可得到在靈芝三萜化合物中C11位沒有羰基，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在共軛雙鍵，其吸收強度大多在l0gε3.7～4.1之間。

（3）紅外光譜掃描分析

由圖12可知，在3446cm-1處有一組比較寬的強吸收峰，說明存在分子間氫鍵O-H伸縮振動；1137cm^-1處有一組強吸收峰，表明該物質(zhì)分子中含有羥基；在2360cm^-1處的吸收峰表明該物質(zhì)中含有羧基；在1647cm^-1處有較強的吸收峰，則表明該物質(zhì)中含有α、β-不飽和酮；而在1458cm^-1～1217cm^-1中的1294cm^-1、1398cm^-1處的吸收峰是多氫菲環(huán)的特征吸收峰。綜合以上分析，推斷該流分化合物為含有羥基的四環(huán)三萜化合物。
綜合以上分析，推斷該流分化合物為含有羥基的四環(huán)三萜化合物。

三、結(jié)論

采用回流提取法提取靈芝發(fā)酵粉中的三萜化合物，經(jīng)單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計對該提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：料液比=1∶30（g/mL）、回流時間為3h，回流溫度為85℃。在此條件下提取三萜類化合物的平均得率為0.6760mg/g。

通過硅膠柱層析分級得到1組流分，經(jīng)高效液相色譜檢測，發(fā)現(xiàn)該組流分含有2個組分。對純化后的靈芝三萜樣品進行了紅外和紫外結(jié)構(gòu)分析，確定靈芝發(fā)酵粉中其中一流分為含有羥基的四環(huán)三萜化合物，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在有共軛雙鍵。通過對靈芝三萜化合物提取和結(jié)構(gòu)初步鑒定，不僅為產(chǎn)品質(zhì)量檢驗提供的理論基礎(chǔ)，可以更好的了解其功能性。

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