5、顯色反應(yīng)時(shí)間影響

取50ml容量瓶一只，加入CAT樣液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H202基質(zhì)液2.00mL，25℃水浴反應(yīng)30min后立即加入1.5mL硫酸終止反應(yīng)，加碘化鉀5mL，60℃水浴加熱40min，冷卻，加淀粉3mL，定容，以蒸餾水作參比液，在波長(zhǎng)600nm處測(cè)吸光度A，同時(shí)完成酶空白試驗(yàn)吸光度A₀測(cè)定，根據(jù)△A(△A=A₀一A)確定過(guò)氧化氫酶活性E。其它條件不變，只改變反應(yīng)時(shí)間，測(cè)定5～70min內(nèi)A值(圖3)。30min內(nèi)吸光度與時(shí)間有線性關(guān)系。由此可見(jiàn)，H₂O₂氧化KI具有零級(jí)反應(yīng)的特點(diǎn)，反應(yīng)物起始濃度直接決定了反應(yīng)速度，40min后反應(yīng)完全。所以顯色反應(yīng)時(shí)間確定為40min。

6、酶促反應(yīng)時(shí)間影響

取過(guò)氧化氫酶工作液10.00mL作測(cè)試液，其它條件不變，改變酶促反應(yīng)時(shí)間，測(cè)定△Ao以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，△A為縱坐標(biāo)作酶促反應(yīng)曲線。由圖4可知：在反應(yīng)初始階段的0～30min內(nèi)，In△A與時(shí)間成正比，符合酶促催化一級(jí)反應(yīng)特征。30min后，△A趨于恒定。因此，確定酶促反應(yīng)時(shí)間為30min。

7、工作曲線

取過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00—20.00mL作測(cè)試液，在最佳條件下完成△A測(cè)定，繪制工作曲線(圖5)。過(guò)氧化氫酶活力E(U／mL)在0.002～0.04U／mL范圍內(nèi)與△A呈良好的線性關(guān)系：△A=0.06843+16.9866E(U／mL)，r=0.9970。按實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定空白10次，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.01，檢測(cè)限為0.0018U／mL，最低檢出量達(dá)到0.15U。

8、干擾試驗(yàn)

取10.00mL過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)溶液作測(cè)試液，按照試驗(yàn)方法考察生物組織共存還原性物質(zhì)干擾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2倍于基底液濃度的葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖不影響酶活度測(cè)定，測(cè)量誤差小于5％。

9、樣品分析

H₂O₂是動(dòng)物肝臟細(xì)胞代謝中間產(chǎn)物，因而肝臟中具有較多的CAT，實(shí)驗(yàn)選取魚(yú)肝臟CAT提取液做分析。將新購(gòu)活魚(yú)殺死，剝離肝臟，用濾紙吸干，稱重，按1:10(w／V)加入1～4℃冷0.25mol／L蔗糖液，勻漿，1500r／min下離心5min，取上清液，用0.25mol／L蔗糖稀釋50倍，制得酶粗液，1～4℃環(huán)境中保存。取酶粗液1.00mL完成活性測(cè)定，平行六次，計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算回收率。

回收率控制在96％～105％范圍內(nèi)，說(shuō)明粗酶液共存物質(zhì)不影響酶活性測(cè)定；根據(jù)測(cè)定結(jié)果可推算出魚(yú)肝CAT含量分別為550U／g(鯉魚(yú))和537U／g(草魚(yú))。

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