2、色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化
（1）流動相的選擇
反相色譜的流動相通常由水和有機溶劑（如甲醇、乙腈）等組成，由于某些被測物極性較強，流動相的洗脫能力不宜過強，同時待分離的16種添加劑有些極性相近，保留時間相近，采用乙腈為有機相時導致幾個組分“共流出”情況較甲醇嚴重，而甲醇可使16種添加劑的保留時間相對延遲，同時甲醇可以提高離子化程度，峰面積比用乙腈為流動相時大，故選擇甲醇為實驗的有機相；又由于流動相要進入質(zhì)譜儀，添加一定量的緩沖溶液可以增加響應值，所以考慮甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸水溶液3種流動相體系。

以被測物在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標對3種流動相體系進行了比較。結(jié)果表明，體系中添加了乙酸銨不僅更有利于分離物質(zhì)在色譜柱上的保留，而且能夠提高色素類物質(zhì)的電離化程度，增加信號響應，從各物質(zhì)分離度、峰形、響應值以及保留時間的穩(wěn)定性等指標進行綜合衡量，甲醇-10mmol/L乙酸銨作為流動相時，優(yōu)于其余兩種流動相，故實驗選用甲醇-10mmol/L乙酸銨為流動相進行梯度洗脫。
（2）柱溫的選擇
柱溫能夠影響色譜柱的柱效、選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性，柱溫的改變直接影響分離效果及分離速率。升高柱溫，色譜柱內(nèi)離子交換速率隨之升高，有利于提高柱效、縮短分析時間。本實驗考察了柱溫分別為30℃、35℃、40℃時，16種添加劑保留時間及響應值的差別，發(fā)現(xiàn)當柱溫為30℃時，16種添加劑有13種出峰時間均集中在3～4min，分離度差；提高柱溫至35℃時，柱效提高，分離度和靈敏度均有改善，繼續(xù)提高柱溫，分離情況無明顯變化?？紤]到色譜柱在相對較低溫度下使用壽命較長，本實驗設定柱溫為35℃。優(yōu)化條件下16種添加劑的MRM質(zhì)譜圖見圖1。

（3）質(zhì)譜條件的選擇
為獲得最佳的靈敏度和分離效果，根據(jù)16種添加劑的分子結(jié)構(gòu)特征，在正、負兩種電離模式下優(yōu)化被測物的母離子和特征子離子以及相應的質(zhì)譜參數(shù)。取質(zhì)量濃度為1mg/L的16種化合物單標準溶液依次采用不接色譜柱直接進樣方式進行質(zhì)譜全掃描檢測，得到目標分析物一級質(zhì)譜圖，再用氬氣轟擊該母離子，得到其二級質(zhì)譜圖，利用儀器的自動優(yōu)化功能，分別對Q1、Q3、CE等進行優(yōu)化，確定16種添加劑的母離子和子離子的最佳質(zhì)譜條件，以強度較大的子離子作為定量離子，強度稍小的子離子為定性離子。
3、方法學評價
（1）方法的線性范圍和檢出限
將含16種被測物的混合標準儲備液添加至稀釋5倍的空白葡萄酒樣品中，分別配制系列混合標準工作液。

色譜柱：AcquityUPLCHSST₃柱（100mm×2.1mm,1.8µm，美國Waters公司）。流動相：（A）甲醇和（B）10mmol/L乙酸銨水溶液，流速0.35mL/min；梯度洗脫程序為：0min，甲醇的體積分數(shù)為10%；0～3min，甲醇的體積分數(shù)從10%升至90%，并保持2.5min，5.5～5.51min；甲醇的體積分數(shù)從90%降至10%；5.51min～6.5min，甲醇的體積分數(shù)保持10%。柱溫為35℃；進樣體積：2μL。

分析儀器：LCMS-8050；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正負離子同時掃描；離子源接口電壓：0.5kV；霧化氣：氮氣3.0L/min；干燥氣：氮氣10L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)；駐留時間：15ms；延遲時間：3ms；以各組分定量離子色譜峰面積對相應的質(zhì)量濃度繪制各被測物的標準工作曲線，結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r²）都在0.995以上。

用葡萄酒樣品低加標水平計算各組分的檢出限和定量限，用信噪比為3確定方法的檢出限（LOD），用信噪比為10確定方法的定量限（LOQ），各組分在葡萄酒樣品中的檢出限范圍在0.2～2μg/L之間。結(jié)果見表2。

（2）精密度和回收率
用微量移液器向空白葡萄酒樣品中準確加入一定量的16種待測物混合標準溶液，配成低、中、高3個濃度水平進行回收率實驗。分別準確稱取16種添加劑標準品于10mL棕色容量瓶中，用水或甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的單標儲備液，于-18℃下避光保存。用甲醇稀釋并配制中間濃度的標準工作液，于4℃避光保存。

根據(jù)需要用流動相逐級稀釋，配制成適當濃度的混合標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取葡萄酒樣品2.0mL于10mL容量瓶中，用超純水定容，超聲混勻，過0.22μm濾膜，濾液供測定。

色譜柱：AcquityUPLCHSST3柱（100mm×2.1mm,1.8µm，美國Waters公司）。

流動相：（A）甲醇和（B）10mmol/L乙酸銨水溶液，流速0.35mL/min；梯度洗脫程序為：0min，甲醇的體積分數(shù)為10%；0～3min，甲醇的體積分數(shù)從10%升至90%，并保持2.5min，5.5～5.51min；甲醇的體積分數(shù)從90%降至10%；5.51min～6.5min，甲醇的體積分數(shù)保持10%。

柱溫為35℃；進樣體積：2μL。

分析儀器：LCMS-8050；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正負離子同時掃描；離子源接口電壓：0.5kV；霧化氣：氮氣3.0L/min；干燥氣：氮氣10L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)；駐留時間：15ms；延遲時間：3ms。

進行6次重復實驗，計算其回收率及相對標準偏差（RSD）。結(jié)果表明，各目標物平均回收率在89.1%～106.4%之間，相對標準偏差小于9.7%，方法的準確度和精密度均符合多殘留分析的要求。
4、實際樣品的測定
按所建立的方法對采購的10批次葡萄酒樣品進行了16種添加劑的篩查，每個樣品重復測定3次。所檢葡萄酒樣品中有1個檢出糖精鈉和甜蜜素，含量分別為26.3μg/L、38.9μg/L，其余樣品的檢測結(jié)果均為陰性。陽性樣品的MRM質(zhì)譜圖見圖2。

三、結(jié)論
本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時測定葡萄酒中甜味劑、防腐劑和色素含量的方法，前處理簡單、分析速度快、準確度和靈敏度高。實際樣品的檢測表明，該方法能夠滿足葡萄酒甜味劑、防腐劑和色素殘留的分析要求，與國標方法相比，大大提高了分析效率和降低了分析成本，能夠滿足葡萄酒中痕量分析要求，非常適合大批量葡萄酒樣品中16種添加劑的定性和定量分析。

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