鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛的新鮮或干燥莖，其為藥食兩用植物。長(zhǎng)期以來(lái)，許多東方國(guó)家將石斛用于草藥制劑中，而在中國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)60種石斛。鐵皮石斛具有很好的抑制衰老、抑制腫瘤、抗氧化、提高機(jī)體免疫能力的功效，并且可用于腫瘤、糖尿病、慢性咽炎胃炎、機(jī)體免疫下降等的輔助治療。生物堿類、多糖類、菲類等物質(zhì)為鐵皮石斛的主要化學(xué)成分，其中多糖是其主要有效成分且較之生物堿和菲類，多糖含量較高。

近年來(lái)，人們對(duì)多糖的功效認(rèn)知逐漸增多，鐵皮石斛多糖的研究也越來(lái)越多。尚喜雨用水提法、酶法對(duì)鐵皮石斛多糖的提取進(jìn)行了研究，分別得到最佳提取條件后，以最佳提取條件進(jìn)行提取并比較提取得率，結(jié)果水提法的多糖平均提取率為12.07％，酶法的多糖平均提取率為20.84％。何鐵光等從鐵皮石斛原球莖中提取得到多糖DcPPla-1，并研究了DCPPla-1對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除作用，發(fā)現(xiàn)多糖DCPPla-1對(duì)二者的清除作用均比較明顯，同時(shí)多糖DcPPla-l對(duì)由Fe²⁺和H₂0₂誘導(dǎo)的小鼠肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化具有極顯著的抑制作用(P＜0.01)。查學(xué)強(qiáng)等研究了鐵皮石斛多糖對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除作用及對(duì)烷基自由基引發(fā)的亞油酸氧化體系的抑制作用，結(jié)果表明，多糖對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基具有不同程度的清除作用，對(duì)烷基自由基引發(fā)的亞油酸氧化體系有顯著的抑制作用。

本文采用正交試驗(yàn)方法，確定鐵皮石斛多糖的最佳提取工藝條件。并通過(guò)測(cè)定鐵皮石斛多糖對(duì)1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、超氧陰離子(02-)、羥基自由基(-OH)的清除能力以及鐵皮石斛多糖對(duì)三價(jià)鐵的還原能力來(lái)研究其抗氧化活性。

一、材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

鐵皮石斛干燥莖由江蘇益斛生物科技有限公司提供；無(wú)水乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚等均為分析純，DPPH、水楊酸、抗壞血酸、雙氧水、鐵氰化鉀等均為分析純化學(xué)試劑，均由天津江天化工有限公司提供。

2、實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備有HW-SY型電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)；TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；LGJ-0.5型冷凍干燥機(jī)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠)；Model680型酶標(biāo)儀(ThermoElectronU.S.A)。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）鐵皮石斛多糖的提取

將干燥的石斛莖粉碎，過(guò)篩。稱取10g粉末，用石油醚在80℃下回流提取3h進(jìn)行脫脂，然后過(guò)濾。濾渣繼續(xù)用無(wú)水乙醇回流提取3h進(jìn)行脫色，過(guò)濾并干燥，加入適量體積倍數(shù)的蒸餾水在恒溫水浴鍋中提取多糖，得到多糖提取液，進(jìn)行多次提取，提取液合并濃縮；采用Sevag試劑脫蛋白5次，然后旋蒸除去Sevag試劑；水層用去離子水透析24h，再加入4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀；離心后，沉淀物依次用乙酸乙酯和丙酮洗滌，沉淀溶解在水中并凍干，得到鐵皮石斛多糖。多糖得率計(jì)算公式：

多糖得率(％)=(鐵皮石斛多糖質(zhì)量／鐵皮石斛粉末質(zhì)量)×100

(2)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

以鐵皮石斛多糖的提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察熱水浸提中提取時(shí)間、料液比、提取溫度、提取次數(shù)四個(gè)因素對(duì)鐵皮石斛多糖提取的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果確定各個(gè)因素的水平范圍并以此進(jìn)行正交試驗(yàn)。

(3)鐵皮石斛多糖對(duì)DPPH清除能力的測(cè)定

根據(jù)Sllimada等的方法測(cè)定鐵皮石斛多糖的DPPH清除能力，并進(jìn)行了一些修改。將多糖樣品配制成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0m咖L的多糖溶液，然后準(zhǔn)確吸取2.0mL多糖溶液加入到由鋁箔覆蓋的試管中，再分別加入0.2mmol／L的DPPH-乙醇溶液2.0mL，劇烈振蕩、混勻，避光反應(yīng)30min。在517nm處測(cè)定其吸光度值，每個(gè)樣品濃度測(cè)定三組平行。同時(shí)用維生素C溶液作陽(yáng)性對(duì)照。
DPPH自由基清除活性(RSA)計(jì)算公式如下：
 

式中：A₁為DPPH-乙醇溶液和蒸餾水的吸光度值；

A₂為樣品溶液和無(wú)水乙醇溶液的吸光度值；

A₃為DPPH-乙醇溶液和樣品溶液的吸光度值。

（4）鐵皮石斛多糖對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定

根據(jù)查學(xué)強(qiáng)和王麗霞等的方法測(cè)定鐵皮石斛多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力，并進(jìn)行了部分修改。將多糖樣品配制成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，將pH為8.2的50mmol／L的Tris-HCl緩沖液在25℃下預(yù)熱20min，然后吸取Tris-HCl緩沖液2.0mL和0.5mL多糖溶液混勻，立即加入1.0mL7mmo兒的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻，在25℃下反應(yīng)5min，在325nm處測(cè)定其吸光度值，每個(gè)樣品濃度測(cè)定三組平行。同時(shí)用維生素C溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

超氧陰離子清除活性(RSA)計(jì)算公式如下：

（5）鐵皮石斛多糖對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)smironoff和wang等提出的方法測(cè)定鐵皮石斛多糖對(duì)羥基自由基的清除能力，并加以改進(jìn)。將多糖樣品配制成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，然后吸取2.0mL多糖溶液與2.0mL9mmol／L的Fes0₄和2.0mL9mmol／L的水楊酸-乙醇溶液，混合，靜置10min，加入2.0mL8.8mm01幾的H₂0₂，在37℃下反應(yīng)30min，在510nm處測(cè)定其吸光度值，每個(gè)樣品濃度測(cè)定三組平行。同時(shí)用維生素C溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

羥基自由基清除活性(RSA)計(jì)算公式如下：

式中：A₁為不加樣品的溶液的吸光度值；

A₂為不加水楊酸-乙醇的溶液的吸光度值；

A₃為樣品溶液的吸光度值。

（6）鐵皮石斛多糖還原能力的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)所述方法測(cè)定鐵皮石斛多糖的還原能力，并進(jìn)行一些修改。將多糖樣品配制成濃度梯度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，將1.0mL多糖溶液、2.5mLpH為6.6的0.2mol／L磷酸鹽緩沖液、2.5mL1％鐵氰化鉀溶液混合，在50℃水浴中反應(yīng)20min后加入2.5mL10％的三氯乙酸，搖勻后離心(400r／min)。吸取2.5mL上清液，然后加入2.5mL蒸餾水、6.5mL0.1％氯化鐵溶液，靜置反應(yīng)10min，在700nm處測(cè)定其吸光度值，每個(gè)樣品濃度測(cè)定三組平行。同時(shí)用維生素C溶液作陽(yáng)性對(duì)照。以吸光度值表示其還原能力。

二、結(jié)果與分析

1、正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的各因素水平范圍得到正交因素水平表，如表1所示。根據(jù)因素水平表進(jìn)行L₉(3⁴)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果如表3所示。

根據(jù)表2中的R值可知R_A＞R_B＞R_C＞R_D，則四個(gè)因素對(duì)多糖提取得率影響由大到小為提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度＞提取次數(shù)。根據(jù)K值確定各因素最佳水平，考慮到試驗(yàn)所需的時(shí)間、原料等因素，確定提取次數(shù)為3次。最終得到鐵皮石斛多糖提取的最佳提取條件為A₂B₃C₂D₂，即提取時(shí)間2h，料液比1:80，提取溫度80℃，提取次數(shù)3次。由表3方差分析結(jié)果可知通過(guò)在0.05顯著水平上的檢驗(yàn)，提取時(shí)間和料液比兩種因素對(duì)鐵皮石斛多糖提取得率有顯著影響。

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