花椒是指蕓香科青椒和紅花椒等去除種子和雜質(zhì)的干燥成熟果皮，主要是作為中藥和食物調(diào)味品?；ń吩谌澜?50多種，主要分布于亞洲、非洲、美洲及大洋洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)，亞洲是花椒主產(chǎn)區(qū)，中國(guó)約有45種，13個(gè)變種。花椒在我國(guó)栽培歷史悠久，在我國(guó)的應(yīng)用已有兩千余年的歷史，它有一定的藥效成分，有殺蟲(chóng)、止癢、抑菌、抑制血小板凝集、抗氧化等作用?；ń分械闹饕瘜W(xué)成分有酰胺、生物堿、木脂素、揮發(fā)油等。

酰胺類物質(zhì)是花椒的主要麻味成分，也是花椒主要的風(fēng)味物質(zhì)。目前，從花椒中分離得到的麻味物質(zhì)總共25種，為一類鏈狀不飽和脂肪酰胺物質(zhì)，其中山椒素是代表性的麻昧物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的刺激性，結(jié)晶后為白色晶體。其化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，在室溫下放置幾分鐘后立刻變成黃色膠狀，易溶于甲醇和丙酮，熱乙醇，難溶于氯仿，不溶于石油醚，因此花椒酰胺類物質(zhì)需在低溫低氧的條件下密封保存。由于花椒麻味物質(zhì)不易保存，用HPLC法對(duì)花椒中麻味物質(zhì)的檢測(cè)多在麻味物質(zhì)分離純化過(guò)程中，并采用與麻味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定等相結(jié)合方式，具有操作繁瑣等缺陷。目前，國(guó)內(nèi)外尚未建立有關(guān)花椒麻味物質(zhì)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)方法，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)于花椒的質(zhì)量控制并沒(méi)有全面反映花椒活性成分，也未有可用于麻味檢測(cè)的參比樣品。因此，應(yīng)用HPLC法檢測(cè)花椒麻味物質(zhì)含量就必須要制備標(biāo)準(zhǔn)品，這就加大了檢測(cè)其含量的難度，從而限制了花椒的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)體系等方面的應(yīng)用。本文以實(shí)驗(yàn)室自制的花椒麻味物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立了HPLC定量檢測(cè)花椒麻味物質(zhì)含量方法。期望為食品工業(yè)中花椒原料的篩選提供一定的理論依據(jù)，也為花椒產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究奠定基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1、實(shí)驗(yàn)材料

整粒花椒樣品干燥粉碎，過(guò)60目篩(孔徑＜O.03mm)，備用，采自全國(guó)的花椒生產(chǎn)基地，如四川、陜西、云南等地；甲醇：分析純，成都科龍?jiān)噭S；甲醇：色譜純，天津四友試劑公司。

2、主要設(shè)備

分析型高效液相色譜儀：LC-10AT型，配有紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，日本島津公司；色譜柱：HC-C18型，安捷倫公司；電子天平：FA2004型，感量O.0001，上海精密電子儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9030型，上海-恒科學(xué)儀器有限公司。

3、方法

（1）花椒麻味物質(zhì)的提取

將花椒麻味物質(zhì)的提取可采用有機(jī)溶劑浸提法。操作方法是：稱取一定量粉碎混勻后的花椒粉末，加入20倍的分析純甲醇于40℃～50℃水浴振蕩浸提后，離心過(guò)濾，取其上清液定容得待測(cè)樣品液。

（2）色譜條件

檢測(cè)條件：島津LC-10AT型分析型高效液相色譜儀，HC-C18型色譜柱，以1.0mL／min15min50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫，柱溫為35℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

（3）檢測(cè)方法

高效液相色譜(HPLC)的檢測(cè)方法：外標(biāo)法。以實(shí)驗(yàn)室自制的花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)甲醇溶液溶解并定容后配成一系列不同梯度的標(biāo)樣溶液。分別吸取一定量的標(biāo)樣注入色譜柱中，測(cè)出色譜圖中各目的物的峰面積，然后以HPLC的峰面積作為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的花椒麻味物質(zhì)含量作為橫坐標(biāo)作圖，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后吸取同等量經(jīng)預(yù)處理的待測(cè)樣品液，與相同條件下檢測(cè)，從色譜圖上測(cè)出花椒麻味物質(zhì)的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對(duì)應(yīng)的待測(cè)樣品中花椒麻味物質(zhì)的含量。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)品(55μg／mL)，采用甲醇配制成一系列質(zhì)量濃度的花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(μg／mL)：O、10、20、30、40、45。然后分別抽取20μg溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。以保留時(shí)間為22～24min的峰為目的峰，以其HPLC峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）方法學(xué)驗(yàn)證

分別對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率的分析測(cè)定。

二、結(jié)果

1、最佳色譜分析條件的確定

經(jīng)過(guò)大量的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，分析研究了柱溫對(duì)分離效果的影響。在柱溫為室溫25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、45℃等溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)柱溫為35℃時(shí)，理論塔板數(shù)最高，洗脫峰時(shí)間間隔最大。研究中還發(fā)現(xiàn)，花椒麻味物質(zhì)含量在0～300μg／mL范圍內(nèi)，花椒麻味物質(zhì)的含量和響應(yīng)峰的面積具有較高的線性相關(guān)度。

（1）洗脫劑最佳流速的確定

為了探求最佳的分離條件，在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫35℃，用15min的50％～70％甲醇和水溶液梯度洗脫以及10min70％甲醇和水溶液洗脫，流速在0.8～1.2mL/min進(jìn)行檢測(cè)，分離效果和峰形都一致(圖l，2，3)。在1.2mL／min時(shí)出峰時(shí)間最快，效率最高，但考慮到1.2mL／min時(shí)色譜柱柱壓過(guò)高，會(huì)嚴(yán)重影響色譜柱的使用年限，綜合考慮流速1.OmL/min為最佳效果。

（2）洗脫劑最佳梯度的確定

當(dāng)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫為35℃，流速為1.0mL／min時(shí)，采用10min的50％甲醇和水溶液梯度洗脫，15min70％甲醇和水溶液洗脫；70％甲醇等度洗脫，采用15min的50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫；以及其他梯度洗脫進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明檢測(cè)條件為15min的50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液時(shí)，洗脫的分離效果和峰形最佳。

因此，本實(shí)驗(yàn)中所確定的HPLC檢測(cè)條件為：島津LC-10AT型分析型高效液相色譜儀，色譜柱為HC-C18柱(4.6mm×250mm)，15min的50％甲醇和水溶液梯度進(jìn)行洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫35℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

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