黃曲霉毒素是二氫呋喃香豆素的衍生物，是一類主要由黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉等產(chǎn)生的高毒性的次級代謝產(chǎn)物，具有很強的致癌、致畸和致突變性。目前發(fā)現(xiàn)20多種AFs，其中AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂為天然毒素，其他毒素主要由這4種衍生得到，已經(jīng)鑒定得到10多種常見的AFs結(jié)構(gòu)。其中，AFB是自然界發(fā)生的最常見的、毒性最強的化學致癌物，被國際腫瘤研究機構(gòu)劃定為Ⅰ級致癌物質(zhì)，并且未規(guī)定安全劑量。目前，對AFs的脫除方法有物理脫除（物理吸附、擠壓膨化、輻射處理、微波、等離子體降解等）、化學脫除（臭氧、氨氣熏蒸、生物堿、乳酸等）及生物脫除（生物吸附、生物降解等）等方法，前2種方法存在效果不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分損失較大以及難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點，而生物脫除法由于過程溫和、無營養(yǎng)物質(zhì)大量流失及本身和降解生成物不會對人畜造成危害等優(yōu)點受到學者的廣泛關(guān)注并展開了諸多研究。

漆酶（ECI.10.3.2）是一種含銅的氧化還原酶，屬藍多銅氧化酶家族，廣泛分布于自然界的昆蟲、高等植物、真菌（擔子菌、子囊菌和半知菌中較多）和細菌中。漆酶具有廣泛的作用底物，能催化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體類及其他一些雜環(huán)類化合物發(fā)生氧化生成水而不產(chǎn)生有害的過氧化氫和活性氧等中間產(chǎn)物?；诖司G色催化特性，漆酶在工業(yè)廢水處理、紡織染料漂白、紙漿木質(zhì)素去除、土壤和水的生物修復等環(huán)境生態(tài)領(lǐng)域有非常廣泛的應用，在生物燃料電池、生物傳感器、制藥等方面的經(jīng)濟價值也得到飛速擴展和提升。關(guān)于漆酶對AFB₁降解的研究卻甚少，且主要集中在降解率的測算上，可達到55%～87.34/%，然而對生成的代謝物結(jié)構(gòu)的認識并不明確。

隨著漆酶分子生物學研究的不斷深入，近年來一些真菌漆酶的晶體結(jié)構(gòu)相繼被解析，為進一步揭示真菌漆酶的催化機制提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而晶體的獲得較為復雜，在某些已知漆酶晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上同源模建可以最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結(jié)構(gòu)，而分子對接技術(shù)可以將獲得的三維結(jié)構(gòu)分子逐一放在靶標分子的活性位點處，通過模擬小分子配體與生物大分子受體相互作用，預測其結(jié)合模式和親和力。分子對接是探索真菌漆酶酶促降解AFB₁規(guī)律和機制的重要手段，對于預測漆酶降解AFB₁效果有重要的意義，而通過實驗制備理論預測效果好的改性漆酶將進一步明晰其催化和降解機制。本研究通過分子對接模擬漆酶與AFB，的結(jié)合模式并用實際降解實驗驗證，利用超高效液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，進一步豐富AFs解毒機理等相關(guān)理論，為漆酶降解AFB₁的可行性提供一定的參考。

一、材料與方法

1、材料與試劑

本實驗所用產(chǎn)重組漆酶LAC3的釀酒酵母菌株由Dr、ThierryTron's實驗室贈送。

三氯甲烷（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純），美國MerdaTechnologyInc公司；AFB，百靈威科技有限公司。

2、儀器與設(shè)備

CR22N高速冷凍離心機，日本Himac有限公司；ZWY-200D智誠恒溫振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；HPLC-TripleQ-LC-MS，美國Agilent公司；UPLC-Triple-TOF-MS，美國Waters公司。

3、方法

（1）栓菌漆酶的同源模建

漆酶的目的基因序列通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進一步核實，對應的ID為Q6TH77。通過BLAST選擇了蛋白數(shù)據(jù)庫PDB中ID為3KW7的漆酶作為模板（氨基酸序列相似性均大于65%），采用MOEv2014.0901軟件進行同源模建。在pH7和溫度300K條件下利用LigX優(yōu)化蛋白質(zhì)的質(zhì)子化狀態(tài)和氫原子的取向。首先，將目標序列與模板序列比對，并構(gòu)建10個獨立的中間模型。這些不同的同源模型是不同環(huán)候選物和側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的排列選擇的結(jié)果。根據(jù)GB/VI的打分函數(shù)得分最高的被選為最終的模型，使用AMBER12/EHT高壓力場進一步能量最小化。

（2）AFs三維結(jié)構(gòu)繪制

用ChemBioDraw2014軟件繪制AFB1二維結(jié)構(gòu)圖，并通過軟件MOEv2014.0901中的EnergyMinimize模塊進行能量優(yōu)化，轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)。

（3）漆酶與AFB1分子對接

應用軟件MOEv2014.0901中的Dock模塊，預測AFs和同源模建蛋白漆酶的結(jié)合能力。在正式對接之前，選擇AMBER12:EHT力場以及R-field隱式溶劑模型。對接流程采用柔性的inducedfit模式，受體結(jié)合口袋氨基酸的側(cè)鏈可根據(jù)配體構(gòu)象進行優(yōu)化調(diào)整，約束側(cè)鏈轉(zhuǎn)動的權(quán)重設(shè)置為10。AFs的結(jié)合模式首先通過LondondG打分函數(shù)進行排序，前30個構(gòu)象通過進一步力場優(yōu)化和GBVI/WSAdG方法進行再次評價。采用最佳結(jié)合構(gòu)象模型將配體對接到漆酶的活性位點，根據(jù)對接分數(shù)、氫鍵作用和關(guān)鍵氨基酸位點分析對接結(jié)果。

（4）AFs標準溶液的制備

分別準確稱量1mg的AFB₁標準品，溶解于1mL色譜級甲醇中，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的標準儲備液，并進行梯度稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的標準工作液用于降解實驗和標準曲線的繪制，-20℃避光保存，待用。

（5）菌株活化及發(fā)酵液制備

菌株活化培養(yǎng)基（S-Gal平板）:酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸緩沖液50mmo/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80mg/L，硫酸銅100μmol/L，愈創(chuàng)木酚0.02%，瓊脂15g/L。

漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基（S-Gal）:酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸緩沖液50mmol/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80mg/L，硫酸銅100μumol/L。

將菌株轉(zhuǎn)接到S-Gal平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2～3d，進行活化。將產(chǎn)漆酶的釀酒酵母菌株接種到裝有S-Gal培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于30℃、160r/min搖床培養(yǎng)4d，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)。在8000r/min條件下離心30min沉淀菌體，上清液即為漆酶粗酶液，并根據(jù)LiuYingli等的方法進行漆酶純化。

（6）漆酶活力檢測

根據(jù)呂春鶴等提供的方法并進行改進測定漆酶活力。在30℃、420nm波長下連續(xù)監(jiān)測2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）的氧化速率，在石英比色皿中分別加入pH4.0的0.04mol/LBritton-Robison緩沖液和0.5mmol/L的ABTS溶液，漆酶1min氧化1μmol底物定義為1個活力單位。

（7）漆酶與AFs作用的降解條件

孵育時間對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標準溶液渦旋振蕩混勻，置于30℃、200r/min分別孵育12、24、36、48h和60h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其他條件相同。

孵育溫度對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標準溶液渦旋振蕩混勻，分別置于25、30、35、40℃和45℃溫度下，200r/min孵育12h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其他條件相同。

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