1.4 引物特異性檢測

引物 A5/A9、C3/C8 對馬鈴薯粉痂菌基因組DNA及其他 11 個非靶標菌株基因組 DNA進行普通 PCR；引物 QF/QR 對馬鈴薯粉痂菌基因組 DNA 及其他 11 個非靶標菌株基因組DNA 進行熒光 PCR，ddH2O 作為陰性對照，檢測引物的特異性。普通 PCR 反應體系（50 μL）為：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物（0.1 μmol·μL^-1）各 0.5μL，模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，ddH2O 23.5 μL。

擴增條件為 94 ℃預變性5min，94 ℃變性45s，55℃退火30s，72 ℃延伸45 ，35個循環(huán)；72℃補充延伸 10min。熒光 PCR 反應體系（20 μL）為：2×SuperReal PreMix Plus 10μL，上下游引物（0.1 μmol·μL^-1）各 0.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，ddH2O 8.1 μL。熒光 PCR 反應條件為 95℃預變性 15 min，95℃變性 10 s，60℃退火 32 s，40 個循環(huán)。

1.5 重組質(zhì)粒的制備

馬鈴薯粉痂菌特異性引物 QF/QR 的擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，與 pEASY®-T1 載體于 25℃連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 Trans1-T1 感受態(tài)細胞中。吸取菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的 LB固體平板上，37℃培養(yǎng) 24 h。挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)入含有氨芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r·min^-1振蕩培養(yǎng)12 h后，提取重組質(zhì)粒并進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物送至北京博邁德生物公司測序，驗證是否正確插入目的片段。用測定質(zhì)粒 DNA 濃度和純度，根據(jù)摩爾定律，計算單位體積質(zhì)粒所含的 DNA 拷貝數(shù)濃度。質(zhì)?？截悢?shù)=[質(zhì)粒濃度（ng·μL^-1）×質(zhì)粒體積（μL）×6.02×1023]/[（載體長度 bp+片段長度 bp）×660 g·mol^-1]

1.6 靈敏度檢測使用

NanoDrop 2000 紫外分光光度計，測定馬鈴薯粉痂病菌質(zhì)粒 DNA 濃度，再以 10倍梯度稀釋，分別進行普通 PCR 和實時熒光定量 PCR 擴增，根據(jù)有無擴增條帶及熒光信號值大小，檢測其靈敏度。

1.7 標準曲線建立

將陽性重組質(zhì)粒 DNA 進行 10 倍梯度稀釋，使用引物 QF/QR 進行熒光定量 PCR 擴增。標準曲線的橫坐標和縱坐標分別設定為質(zhì)粒濃度對數(shù)值和循環(huán)閾值，使用 Excel 2010 軟件構(gòu)建馬鈴薯粉痂菌熒光定量 PCR 標準曲線。

1.8 田間土壤及罹病塊莖組織樣品檢測及驗證

分別從云南省邵通市、甘肅省定西市和河北省張家口市采集 18份帶菌土壤和18 份帶菌種薯樣品，按照 1.2 中的方法提取植物組織樣品總 DNA，進行普通 PCR 和熒光 PCR 檢測，
計算檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗證

應用引物 A5/A9 和 C3/C8 對馬鈴薯粉痂病菌和其它 11 株非靶標病原真菌基因組 DNA進行常規(guī) PCR 擴增，結(jié)果顯示僅馬鈴薯粉痂病菌 DNA 擴增出 281 和 391 bp 的目的條帶，而其它供試菌株 DNA 和清水對照未擴增出條帶（圖 2）。應用引物 QF/QR 進行實時熒光定量 PCR 擴增，結(jié)果表明該引物僅對馬鈴薯粉痂病菌有唯一的產(chǎn)物吸收峰（圖 3）。

2.2 靈敏度檢測

利用引物 QF/QR 對不同濃度質(zhì)粒 DNA 進行常規(guī) PCR 和熒光定量 PCR 擴增，結(jié)果表明常規(guī) PCR 靈敏度為 1.38×104 fg·μL^-1，熒光定量 PCR 靈敏度為 13.8 fg·μL^-1，是常規(guī) PCR檢測靈敏度的 1000 倍（圖 4）。

2.3 標準曲線的建立

以不同稀釋濃度的質(zhì)粒DNA為模板，利用引物 QF/QR 進行熒光定量 PCR 擴增，結(jié)果表明，熒光 PCR 熔解峰單峰，標準曲線為 y=-3.8939x+35.228，R2=0.9966，該體系線性關(guān)系良好（圖 5）。

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