3分析與討論

3.1不同試劑盒對集聚性大腸桿菌基因組的提取效果

分別吸取1 mL培養(yǎng)過夜的集聚性大腸桿菌菌懸液，按照4種細菌基因組提取試劑盒提供的標準方法提取集聚性大腸桿菌基因組，不同試劑盒分別提取的集聚性大腸桿菌基因組純度及濃度見表4?；蚪M質量濃度在10.8~30.4 mg/L，天根試劑盒提取的基因組DNA的質量濃度最低，只有10.8mg/L；寶生物試劑盒提取的質量濃度最高，但也僅為30.4 mg/L。純凈的基因組DNA的260 nm處的吸光度A260與280 nm處的吸光度A280的比值1.8，較純凈的基因組DNA的A260與230 nm處的吸光度A230的比值大于2.0，所提取的基因組DNA的A260/A280的值小于1.66，可能樣品有蛋白質污染；A260/A230的值小于1.12，推測基因組DNA樣品可能含有有機試劑或鹽離子等污染物。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。4種試劑盒所提取的基因組條帶完整性良好，無核糖核酸(RNA)污染，但是用4種方法所提取的基因組的濃度均較低。制備核酸標準樣品時前期的基因組樣品提取工作將耗費大量的資源，為提高產率，需要對提取步驟進行必要的優(yōu)化。從使用4種試劑盒提取EAEC基因組DNA的提取工作耗時由短到長的順序是寶生物、天根、全式金、OMEGA，其中OMEGA試劑盒提取過程耗時最長，天根試劑盒提取濃度過低。從試劑盒購買價格考慮，OMEGA試劑盒（50次）花費648.00元，而天根試劑盒（50次）花費420.00元；但是該試劑盒需自備RNase A，總費用合計720.00元，在4種試劑盒中價格最高，因此，后續(xù)研究將對寶生物試劑盒及全式金試劑盒標準提取方法進行優(yōu)化。

3.2寶生物試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

使用寶生物試劑盒標準提取方法中的革蘭氏陽性菌提取方法，并且增加了對于菌懸液的處理過程。取1 mL培養(yǎng)過夜的EAEC菌懸液，離心分離棄上清后加入500µL的Buffer BS試劑，加入溶菌酶至終質量濃度為2 g/L。在第一步的材料處理時加入蛋白酶K后在56℃的孵育時間由原來的30 min延長至40 min。

優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的純度及濃度見表5。優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的質量濃度為34.1 mg/L，與優(yōu)化前的提取質量濃度30.4mg/L相比，濃度提高較少，提取過程耗時較優(yōu)化前增長了1.5 h，基因組A260/A280及A260/A230的值低于優(yōu)化前。電泳分析結果如圖2所示?？梢钥闯觯瑑?yōu)化后提取的基因組條帶清晰，無RNA污染，說明優(yōu)化后提取基因組效果未能達到快速提取大量高質量基因組的目的。

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