2.4細菌16SrRNA分子鑒定

16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖4)表明,從細菌 菌株的DNA模板中擴增出大小約為1400 bp左右的片 段,符合預期結(jié)果,序列號為MN736843,將基因序列通過NCBI進行同源比對分析,結(jié)果顯示與該序列同 源性比最高的菌株均是豚鼠氣單胞菌，將序列與已知 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),可以看出,該菌株與豚鼠氣單胞菌(A. caviae)聚為一個分支,結(jié)合生化實驗和革 蘭氏染色等結(jié)果,可確定該分離菌株為豚鼠氣單胞菌。

2.5人工感染

經(jīng)過人工感染的羅氏沼蝦出現(xiàn)與自然水域患病蝦 相似的癥狀,感染羅氏沼蝦出現(xiàn)鰓絲紅腫,鰓絲表面出 現(xiàn)黑斑等癥狀(圖6),感染組在7天內(nèi)全部死亡，而對 照組沒有出現(xiàn)異常。從人工感染瀕臨死亡的羅氏沼蝦 肝胰腺組織內(nèi)再次進行細菌分離純化，將分離菌株再 次進行生理生化實驗以及分子學鑒定等,得到與原分 離菌株相同的實驗結(jié)果,證明該分離菌株為羅氏沼蝦致病菌-豚鼠氣單胞菌(A.caviae).

3討論

豚鼠氣單胞菌(A.caviae)隸屬于氣單胞菌科.氣單 胞菌屬，是威脅中國水產(chǎn)養(yǎng)殖動物健康的主要致病菌之一,能夠?qū)е氯毡决狑~(Anguillajaponica).胡子鯰(Clarias fuscus).中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis). 中國 對蝦(Penaeus chinensis). 南方鲇(Silurus meriordinalis Chen)、中華鱉(Triongxsinensis)等多種水產(chǎn)動物感染。本次研究從患病的羅氏沼蝦體內(nèi)分離出致病 菌，井將得到的優(yōu)勢菌株通過細菌形態(tài)觀察.革蘭氏染 色、溶血試驗以及生理生化分析可初步判斷該分離菌 株為豚鼠氣單胞菌(A. caniae).其16S rRNA基因序列 構(gòu)建進化樹,結(jié)果顯示該分離菌株與豚鼠氣單胞菌聚 為一族,綜合所有實驗結(jié)果可確定該分離菌株為豚鼠 氣單胞菌。使用該分離菌株對健康羅氏沼蝦進行人工 感染.感染后的羅氏沼蝦表現(xiàn)出與自然水城條件下患 病蝦相似的癥狀,并對感染后的羅氏沼蝦再次進行細 菌分高純化.得到與豚鼠氣單胞菌相似的菌株,進一一步: 證明了該細菌在羅氏沼蝦體內(nèi)的致病性,同時也對豚 鼠氣單胞菌的病原研究資料進行了一定的補充。

對分離菌株的生理生化特性進行鑒定,該病原菌 對氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖產(chǎn)酸、蛋白胨水.精氨酸水 解酶、明膠.苯丙氨酸為陽性:硫化氫.丙二酸鹽.賴氨 酸脫發(fā)酶。鳥氨酸脫羧酶。枸緣酸鹽.V-P .葡萄糖酸鹽 為陰性,豚鼠氣單胞菌的生理生化特性存在菌株差異 性，本研究分高的豚鼠氣單胞菌對枸櫞酸鹽和蛋白胨 水的鑒定結(jié)果與模式氣單胞菌相反,出現(xiàn)上述差異的 原因可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境、氣候條件.地理位置.寄主 體不同造成的。目前.,在水產(chǎn)動物中普遍使用抗菌藥 物對疾病進行防治，本次研究的藥敏實驗結(jié)果表明,該 分離菌株對頭孢曲松.氣霉素、氟苯尼考四環(huán)素、多西 環(huán)素s種藥物高度敏感,對卡那霉素1種藥物中度敏 感.對環(huán)丙沙星。諾氟沙星、紅霉素.阿奇霉素新生霉 素.鏈霉素.復方新諾明和利福平8種藥物耐藥。本次 研究結(jié)果與已報道的其他品種分高出的脈鼠氣單胞菌 的藥物敏感性存在一-定差異1,這表明豚鼠氣單胞菌 對藥物敏感性存在一-定的差異,這可能和不同的地區(qū)。 不同養(yǎng)殖環(huán)境中藥物種類以及藥物使用程度不同有關于細菌的鑒定方法有很多,例如環(huán)介導等溫擴 增技術.單克隆抗體和間接ELISA法等.16SrRNA在 細菌染色體的基因組中普遍存在,含高度保守區(qū)城且 分子大小始終?；贗6SrRNA基因序列分析具有簡 易、高效等優(yōu)點，已經(jīng)成為細菌鑒定以及親緣關系判斷 的一一種有效的工具,但是因為I6SrRNA可能存在一一些 不清晰的位點且基因數(shù)目有限,所以給序列的分析帶 來不便，本次研究對分離細菌的16SrRNA基因及其系 統(tǒng)進化樹進行分析,并與生理生化特性和革蘭氏染色 等方法相結(jié)合,進而判斷該分離菌株為脈鼠氣單胞菌， 提高了細菌鑒定結(jié)果的準確性和可信度。

目前，已鑒定的氣單胞菌屬主要分離自人和不同 的動物寄主:從患病水生動物以及人感染的傷口中分離-有的還能在食物中分離純化得到PPABLOS等 從腹瀉病患.飲水以及食品分離的氣單型菌進行鑒定﹐ 結(jié)果表明,人源氣單胞菌和飲水源氣單型菌較為接近， 說明氣單型菌可以通過水源傳播到人類,從而導致人 癸產(chǎn)生疾病P樊海平等*從發(fā)生敗血癥的中國對蝦 分離純化出豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌,但是關于 從羅氏沼蝦中分離到豚鼠氣單胞菌以及以豚鼠氣單胞 菌感染為主的羅氏沼蝦疾病的報道較少,羅氏沼蝦豚 鼠氣單胞菌是否能夠?qū)е氯撕推渌鷦游锇l(fā)病﹐它 和人源氣單胞菌有無親緣關系,以及其致病機理均有 特進一步研究。因此,后期還需要進一步進行該病璧 菌的流行病學調(diào)查，了解其發(fā)病的規(guī)律,并確認其危害 的對象以及研究其致胸機理等,將更有利于對該致病 菌引起的羅氏沼蝦疾病進行有效的防控,促進羅氏沼 蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展-

抗生素等藥物是保持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)動物健康生產(chǎn)以 及病 例治的重要途徑。可是由于當前水產(chǎn)市場抗生 素種類太多,以及用藥習慣不一樣，導政漁藥使用相對 混亂,細菌的耐藥現(xiàn)象也越來越嚴重,所以在水產(chǎn)動物 中對抗生素藥物的選擇和使用一定要有科學性,對病 甌菌揉使用抗生素等藥物治療,必須參考其藥敏實驗 結(jié)果,嚴格遵循水產(chǎn)藥物使用的相關規(guī)定﹐同時還要注 愈穿梭用藥以及藥物使用濃度.盡量避免藥物的殘留， 本次研究為羅氏沼蝦豚鼠氣單廄菌鑒定以及病害劭治 提供一定的參考和理論基礎-

4結(jié)論

本研究從患病的羅氏沼蝦中分離出一糅致病菌- 豚鼠氣單胞菌,并通過對其菌落形態(tài)特征.生理生化鑒 定并結(jié)合16SrRNA序列分析,可判斷該致病菌為豚鼠 氣單慰菌.人工感染實驗證實了該致病菌對羅氏沼蝦 具有較強的致病性.藥敏試驗結(jié)果表明該致病菌對頭 泡曲松.氯霉素.氟苯尼考.四環(huán)素.多西環(huán)素5種藥物 高度敏感,而對環(huán)丙沙星.諾氟沙星.紅霉素.阿奇霉 素.新生霉素鏈霉素.復方新諾明和利福平8種藥物 耐藥,因此可參考藥敏試驗結(jié)果對羅氏沼蝦豚鼠氣單 巍菌使用合適的藥物進行治療﹐以達到最佳治療效 果-水研究所選的環(huán)丙沙星和氯霉素僅用來研究菌棵 的抗藥性，并不能用于生產(chǎn),面氟苯尼考可以作為羅氏 沼蝦豚鼠氣單脫菌的主要治療藥物。這也握醒養(yǎng)殖戶 和研究生產(chǎn)人員在羅氏沼蝦養(yǎng)殖過程中,要在國家覺 許藥物使用范圍之內(nèi),選取最佳眩感藥物用來進行病 害防治,提高用藥的針對性，做到合理慎重用藥,盡量 減少藥物殘留.o研籠為進一步探討羅氏沼蝦豚鼠氣 單胞菌的鑒定和防治提供一定的參考.

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