黃嘌呤氧化酶是體內(nèi)尿酸生成的關(guān)鍵酶，它能催化次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸。尿酸過(guò)多可導(dǎo)致痛風(fēng)。全球痛風(fēng)發(fā)病率與日俱增，并呈年輕化趨勢(shì)，成為第二大威脅人類(lèi)生命和健康的代謝性疾病，因此研發(fā)防治痛風(fēng)、高尿酸血癥的藥物成為目前醫(yī)藥界的一個(gè)研究熱點(diǎn)。XOD抑制劑可減少體內(nèi)尿酸生成，預(yù)防痛風(fēng)病。肉桂醛又稱(chēng)桂皮醛，是斯里蘭卡肉桂油、桂皮油、藿香油、風(fēng)信子油和玫瑰油等精油的重要活性成分。肉桂醛具有殺菌消毒、抗?jié)?、抗病毒、抗癌等功能。有研究?bào)道了肉桂揮發(fā)油和肉桂醛的體內(nèi)降尿酸和血清X(qián)OD抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示肉桂揮發(fā)油和肉桂醛具有較好的體內(nèi)降尿酸活性，肉桂醛體外實(shí)驗(yàn)有XOD抑制活性。但活性比陽(yáng)性藥別嘌醇稍弱。另外，Maria等研究表明縮氨基脲類(lèi)席夫堿類(lèi)物質(zhì)有較強(qiáng)的XOD抑制作用?；谌夤鹑┡c席夫堿均能抑制XOD，本研究采取基團(tuán)拼合原理，合成肉桂醛縮氨基脲及縮氨基硫脲類(lèi)席夫堿，并測(cè)定其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用。探討其構(gòu)效關(guān)系，旨在篩選出高效低毒的黃嘌呤氧化酶的抑制劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

氧嗪酸鉀鹽、尿酸、黃嘌呤、別嘌呤醇、黃嘌呤氧化酶：均購(gòu)自美國(guó)Sigma-A1drich公司；肉桂醛、4-甲基氨基硫脲、4-苯基氨基硫脲、氨基脲、氨基硫脲、Na₂HP0₄·12H₂0、NaH₂P0₄·2H₂0、氫氧化鈉、EDTA、DMSO：均購(gòu)自上海國(guó)藥廠，分析純；尿酸測(cè)定試劑盒：購(gòu)自南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)20180530；XOD測(cè)定試劑盒：購(gòu)自南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)20180720。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2450紫外分光光度計(jì)：購(gòu)自日本島津公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、精密電子天平BT25S：購(gòu)自美國(guó)熱電尼高力公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52CS-1：購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ：購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；紅外光譜儀FTIRNicolet5700、高分辨率四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀Agilent6538、核磁共振儀AV-600：均購(gòu)自德國(guó)Bmker公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明種小鼠40只，體質(zhì)量18～22g：由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(贛)2018-003。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)一周，以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)條件：室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度60％-70％。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 肉桂醛衍生物的合成

成將10mmol氨基脲或氨基硫脲類(lèi)物質(zhì)加入100mL三頸燒瓶中，準(zhǔn)確加入15mL無(wú)水乙醇，加熱磁力攪拌器中恒溫70℃回流10min溶解，然后逐滴滴加10mmol的肉桂醛，溶液逐漸變?yōu)辄S綠色，加4滴冰乙酸，回流4h后發(fā)現(xiàn)有固體析出，冷卻至室溫后過(guò)濾，重結(jié)晶，即可得到產(chǎn)物。其中化合物a是肉桂醛縮氨基脲，cinnamicaldehydesemicarbazone，CAS；化合物b是肉桂醛縮氨基硫脲，einnamaldehvdethiosemi-carbazide，CT；化合物c是肉桂醛縮甲基氨基硫脲，cinnamaldehvdeshrinkagemethylthiosemica曲azide，CSMT；化合物d是肉桂醛縮4-苯基氨基硫脲，cinnamaldehvdeshrinkagemethylthiosemicarbazide，CSMT(圖1)。
 

1.4.2 合成化合物的結(jié)構(gòu)表征

通過(guò)UV、IR、¹H-NMR、ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

UV光譜：將肉桂醛衍生物分別溶于無(wú)水乙醇.配成濃度為1×10^-5m01/L的溶液，測(cè)定紫外-可見(jiàn)吸收光譜，測(cè)定波長(zhǎng)為200-600nm。

IR光譜：將肉桂醛衍生物1mg和100mgKBr充分研磨后壓片，在400～4000cm^-1范圍內(nèi)，掃描32次，分辨率為4cm^-1，測(cè)定肉桂醛衍生物的紅外吸收光譜。

¹H-NMR：樣品10mg加入0.5mL氘代溶劑溶解。25℃條件下，配備5mmPABB0探針，在BrukerDRX400MHz波譜儀上進(jìn)行測(cè)定。使用MestReNova軟件處理數(shù)據(jù)。參數(shù)選擇后采樣、傅立葉變換、調(diào)相位、校正零點(diǎn)、積分、定最大最小值、打印圖譜等步驟進(jìn)行氫譜的測(cè)量。

ESI-MS質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，負(fù)離子檢測(cè)，離子源溫度120℃。霧化器壓力206850Pa，干燥氣氮?dú)饬髁?L/min，溫度350℃。毛細(xì)管電壓25kV，錐孔電壓20V，錐孔氣流量50L/h，檢測(cè)電壓l600V。用MassLvnx軟件處理數(shù)據(jù)。

1.4.3 化合物對(duì)XOD酶抑制機(jī)理

1)酶活性測(cè)定

黃嘌呤氧化酶的作用下，黃嘌呤被氧化生成尿酸。實(shí)驗(yàn)方法參照Cos等的方法并略有修改。各化合物分別用DMSO溶解，制備樣品液。黃嘌呤氧化酶水溶液(0.2U/mL)用超純水配制，濃度為0.15mmol/L的黃嘌呤底物溶液用PBS緩沖溶液配制(pH7.5)?？偡磻?yīng)體系3mL，先加入PBS緩沖溶液0.85mL，0.15mmol/L的黃嘌呤底物溶液2mL，再加入0.05mL不同濃度的樣品溶液，混勻1分鐘。然后加入0.1mL黃嘌呤氧化酶水溶液，立即搖勻，25℃水浴，于290nm處測(cè)定酶促反應(yīng)曲線，每隔10s測(cè)一次吸光值，持續(xù)200s。黃嘌呤氧化酶的活性相當(dāng)于曲線線性期部分的斜率。以樣品濃度作橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活作縱坐標(biāo)，作圖得到黃嘌呤氧化酶活性抑制曲線。重復(fù)測(cè)定3次。抑制率為：

抑制率(％)=((S₀-S₁)/S₀)×100％

式中：S₀是無(wú)樣品組別的斜率，S₁是添加樣品組別的斜率。

2)肉桂醛縮氨基脲對(duì)XOD的抑制類(lèi)型

以黃嘌呤為底物，研究肉桂醛縮氨基脲抑制黃嘌呤氧化酶活性的機(jī)理，即可逆抑制或者不可逆抑制。在測(cè)活體系中，固定底物黃嘌呤濃度，依次加入肉桂醛縮氨基脲濃度0、50、75、100μmo此，改變XOD酶的質(zhì)量濃度，測(cè)定不同濃度的抑制劑肉桂醛縮氨基脲對(duì)XOD催化氧化黃嘌呤能力的影響。以酶促反應(yīng)的速度對(duì)酶質(zhì)量濃度作圖，若得到一系列通過(guò)原點(diǎn)的直線，則為可逆抑制；若得到一組平行線，則為不可逆抑制。

3)肉桂醛縮氨基脲對(duì)XOD的抑制常

參照上述酶反應(yīng)體系，以黃嘌呤為底物，研究肉桂醛縮氨基脲對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制常數(shù)。改變加入黃嘌呤的濃度，固定酶的濃度，測(cè)定不同濃度肉桂醛縮氨基脲(0、30、40、60μmol，L)抑制黃嘌呤氧化酶活性的效果。抑制類(lèi)型由Lineweave-Burk雙倒數(shù)作圖法來(lái)判斷?？v坐標(biāo)是直線的斜率或Y軸的截距，橫坐標(biāo)是各化合物濃度，作圖，可計(jì)算相應(yīng)的抑制常數(shù)(K_I或K_IS)。

相關(guān)鏈接：肉桂醛，氨基脲，氫氧化鈉，尿酸

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