2.2 薄層色譜鑒別結(jié)果

根據(jù)2.1薄層色譜鑒別條件，建立槐枝的薄層色譜鑒別方法：稱取槐枝粉末（過(guò)二號(hào)篩）2g，加入石油醚（30～60℃）30mL超聲處理20min，過(guò)濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50mL甲醇超聲處理（500W，頻率40kHz）30min，過(guò)濾，取濾液蒸干，加入2mL甲醇溶解殘?jiān)?，即為供試品溶液。?.2.1方法制備對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（2020年版《中國(guó)藥典：四部》　通則　0502）試驗(yàn)方法，分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（體積比為8∶1∶1∶1）溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置于紫外光燈（365nm）下檢視，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，供試品色譜圖在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上，呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取1.3.2中的對(duì)照品溶液和1.3.3中的供試品溶液，各10μL，按1.3.1色譜條件測(cè)定，理論板數(shù)按蘆丁色譜峰計(jì)不低于3000，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)符合要求。對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖如圖3所示。

2.4 蘆丁含量測(cè)定提取條件選擇

選擇編號(hào)為1^＃的槐枝樣品粉末，分別選擇甲醇、70%乙醇溶液、50%甲醇溶液及50%乙醇溶液4種提取溶劑對(duì)蘆丁進(jìn)行提取，考察不同提取溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以50%甲醇溶液為提取溶劑時(shí)，色譜峰面積最大，基線平穩(wěn)，故采用50%甲醇為提取溶劑。以50%甲醇溶液為提取溶劑，分別采用超聲法（30、60min）、回流法（30、60min）對(duì)蘆丁進(jìn)行提取，考察不同提取方法的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提?。?0、60min）及回流提取（30、60min）的色譜峰面積無(wú)明顯差異，故選用超聲法（30min）對(duì)樣品進(jìn)行提取。

2.5 色譜條件優(yōu)化

分別選用瑞典Nouryon的Kromasil100–5–C₁₈(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱、島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司的VP–ODSC₁₈(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱及美國(guó)安捷倫科技有限公司的AgilentZorbaxSBC18(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱之間無(wú)明顯差異，均能實(shí)現(xiàn)色譜分離，理論板數(shù)，分離度及拖尾因子均符合《中國(guó)藥典》2020年版的規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)選用瑞典Nouryon的Kromasil100–5–C₁₈(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱作為分離柱。

在1.3.1色譜條件下，分別考察了甲醇–0.01mol/L乙酸銨(體積比為47∶53)溶液、甲醇–1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液、乙腈–2.5%冰醋酸（體積比為13∶87）溶液3種流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈–2.5%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖中的溶劑峰明顯；采用甲醇–0.01mol/L乙酸銨溶液、甲醇–1%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，蘆丁的色譜峰尖銳，理論板數(shù)高，分離度良好。由于甲醇–0.01mol/L乙酸銨溶液配制較復(fù)雜，使用鹽溶液操作不當(dāng)容易阻塞色譜柱，損壞高效液相色譜儀，而甲醇–1%冰醋酸溶液配制簡(jiǎn)單，操作容易。綜合考慮，選擇甲醇–1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液為流動(dòng)相。

2.6 線性方程與檢出限

自動(dòng)進(jìn)樣器分別精密吸取1.3.2中的對(duì)照品溶液3、7、10、13、15μL注入液相色譜儀，在1.3.1色譜條件下，依次進(jìn)樣測(cè)定，以蘆丁的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

用甲醇將對(duì)照品溶液稀釋10倍，然后逐級(jí)稀釋進(jìn)樣分析，以3倍信號(hào)和噪音的比值（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為方法檢出限，5倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為定量限。蘆丁的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表1。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇1號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩），精密稱取約0.5g，按照1.3.3方法制備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下，分別于制備完成后第0、1、2、3、5、7、10、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在24h內(nèi)色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 精密度試驗(yàn)

取1號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩）6份，每份約0.5g，精密稱定，按照1.3.3方法制備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，表明該方法精密度較好，滿足測(cè)定要求。

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取1號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩）6份，每份約0.25g，分別加入質(zhì)量濃度為7.54μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液20mL，再精密加入25mL水和5mL甲醇，密塞，稱量并記錄溶液質(zhì)量，超聲處理（500W，頻率40kHz）30min，冷卻，再次稱量溶液質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，在1.3.1色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，樣品加標(biāo)回收率為98.7%～102.2%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.1 實(shí)際樣品測(cè)定

分別精密稱取1～10號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩），各約0.5g，按1.3.3方法制備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，10批槐枝樣品中蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.10%～0.16%之間。不同槐枝樣品之間蘆丁含量差異較大，可能是在槐枝采集過(guò)程中，存在以老枝摻入嫩枝入藥的情形，而老枝中蘆丁的含量較低。

3 結(jié)語(yǔ)

樣品先加石油醚（30～60℃）脫色，然后用甲醇進(jìn)行提取，以乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（體積比為8∶1∶1∶1）為展開(kāi)劑，顯色后斑點(diǎn)清晰，分離度好，可用于槐枝的定性鑒別。采用50%甲醇作為提取溶劑，以甲醇–1%冰醋酸溶液（體積比為32∶68）為流動(dòng)相，建立了高效液相色譜法測(cè)定槐枝中蘆丁含量的方法。該方法簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確可靠，可為槐枝質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

相關(guān)鏈接：乙酸乙酯，石油醚，蘆丁，冰醋酸

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