1.2.5 纖維素酶活力的測定

分離菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，連續(xù)傳代至第3代時(shí)獲取發(fā)酵液，離心取上清液，即為菌株的粗酶液。CMC（羧甲基纖維素）法測定菌株所產(chǎn)纖維素酶的活力。纖維素酶活力定義為1mL酶液在50℃條件下1min水解羧甲基纖維素產(chǎn)生1μg葡萄糖即為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。
 

其中：m：從標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得的葡萄糖毫克數(shù)；n：酶液稀釋倍數(shù)；0.5：測定時(shí)吸取稀釋酶液毫升數(shù)；30：表示反應(yīng)時(shí)間分鐘數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶活性菌株的篩選

從9個(gè)樣品中共分離出21株菌，全部為革蘭氏陽性細(xì)菌，經(jīng)CMC-Na固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，剛果紅染液染色篩選，其中有5株細(xì)菌可在CMC-Na固體培養(yǎng)基上形成透明圈菌落，結(jié)果如圖1所示。W1和W2菌株，來源于納豆樣品W，R菌株來源于納豆樣品R，F(xiàn)3菌株來源于豆豉樣品F，F(xiàn)S來源于豆豉樣品FS。其中，以F3菌株水解CMC-Na的能力最強(qiáng)，即纖維素酶活性最高，F(xiàn)S菌株的活性最低。因此，選取來源于發(fā)酵豆豉的F3菌株做進(jìn)一步研究。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

F3菌株于LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，菌落及革蘭氏染色觀察結(jié)果如圖2所示。F3菌株可在LB固體培養(yǎng)基上形成乳白色、不透明、邊緣不規(guī)則的圓形菌落，表面光滑，隆起，質(zhì)地黏稠拉絲。菌體細(xì)胞為革蘭氏染色陽性，呈短桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)排列，可形成明顯的芽孢。

2.2.2 16SrDNA基因序列分析

F3菌株的16SrDNA基因經(jīng)測序獲得序列長度為1437bp，通過BLAST分析，發(fā)現(xiàn)菌株F3與芽孢桿菌屬同源性最高，隨后將其與芽孢桿菌屬內(nèi)模式菌株的16SrDNA基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，同時(shí)以非同屬的Escherichiacoli模式菌株為外標(biāo)，并利用NeighborJoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

由16SrDNA基因序列比對(duì)分析可知，F(xiàn)3菌株與Bacillusamyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens、Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum兩個(gè)模式菌株的親緣關(guān)系最近，但兩個(gè)模式菌株的16SrDNA基因序列經(jīng)兩端對(duì)齊比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)二者同源性大于99.5%，故無法判定F3菌株具體種的歸屬。對(duì)于親緣關(guān)系較近的種間鑒定僅通過16SrDNA基因序列分析是無法實(shí)現(xiàn)的，需在其基礎(chǔ)上借助于其他特定看家基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行聯(lián)合分析，如gyrA、gyrB、recA、pheS、rpoA等。

2.2.3 gyrB基因序列分析

為了進(jìn)一步鑒定F3菌株，對(duì)其gyrB基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及測序，獲得了gyrB基因的部分序列，長度為1115bp。將該菌株的gyrB基因序列同已知芽孢桿菌屬內(nèi)不同模式菌株的gyrB基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，同樣以非同屬的Escherichiacoli模式菌株為外標(biāo)，繪制基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。

解淀粉芽孢桿菌植物亞種與解淀粉芽孢桿菌解淀粉亞種的gyrB基因序列同源性僅約為96%，而基于gyrB序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)F3菌株與解淀粉芽孢桿菌植物亞種親緣關(guān)系更近。因此，基于16SrDNA和gyrB基因序列比對(duì)分析，可將F3菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌植物亞種。

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