酸漿豆腐是我國特色的傳統(tǒng)食品，其制作的獨特之處在于用酸漿代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鹽鹵和石膏作為凝固劑。酸漿豆腐一直依靠工人多年經(jīng)驗進(jìn)行生產(chǎn)的小作坊制作方式，先將酸漿老湯加入黃漿水，其中的乳酸菌在常溫下將黃漿水自然發(fā)酵為酸漿，再使用酸漿作為酸性凝固劑，通過點漿使豆?jié){凝固制成酸漿豆腐。酸漿豆腐口感細(xì)膩，風(fēng)味獨特，在我國山東等地已經(jīng)作為特色食品被列入“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”。然而手工作坊式的生產(chǎn)方式具有酸漿質(zhì)量無法保障，生產(chǎn)效率低，貨架期不穩(wěn)定等缺點。為了實現(xiàn)酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)，促進(jìn)我國傳統(tǒng)食品的“食文化”廣泛傳播，對酸漿中的乳酸菌進(jìn)行分離篩選，發(fā)掘產(chǎn)酸能力強的菌株井探究其性質(zhì)，為今后酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

部分學(xué)者對豆腐酸漿中的微生物開展了初步探索，喬支紅等利用從豆腐酸漿老湯中篩選到的5株產(chǎn)酸菌發(fā)酵大豆黃漿水，以酸漿的pH值為考察指標(biāo)，探討了單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、發(fā)酵溫度、菌種接種量及菌種的混合比例對酸漿pH值的影響，結(jié)果表明，酸漿純種發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為雙菌混合發(fā)酵，混合比例1∶9（1號菌∶3號菌），接種量5%，發(fā)酵時間24h，發(fā)酵溫度42℃；賀云等從云南牟定地區(qū)的10份自然發(fā)酵酸漿豆腐中分離篩選得到6種乳酸菌，并分別鑒定為類布氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德式乳桿菌和粘膜乳桿菌，其中植物乳桿菌產(chǎn)酸能力最強；劉倩等從豆清發(fā)酵液中分離純化出3株產(chǎn)酸菌，經(jīng)生理生化和16SrRNA基因序列分析鑒定該菌株為產(chǎn)酸解淀粉乳桿菌。但現(xiàn)有研究局限于單一產(chǎn)地，缺乏對全國酸漿菌種差異的整體研究。

本研究從云南建水、陜西榆林、山東鄒平、河北淶源、云南石屏以及北京延慶6個國內(nèi)具有代表性的酸漿豆腐產(chǎn)地中的7種豆腐酸漿老湯中篩選分離各樣品中的高產(chǎn)酸乳酸菌，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，并對其產(chǎn)酸能力、耐酸性、耐鹽性等生長特性進(jìn)行研究，旨在對全國主要酸漿豆腐產(chǎn)地中的產(chǎn)酸菌構(gòu)成及特性進(jìn)行探究，為酸漿中優(yōu)質(zhì)乳酸菌生物資源的篩選以及后續(xù)酸漿生產(chǎn)工業(yè)化奠定基礎(chǔ)、提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

1、材料與試劑

（1）材料

豆腐酸漿老湯：云南建水、陜西榆林、山東鄒平、河北淶源、云南石屏以及北京延慶的酸漿豆腐加工作坊。

（2）培養(yǎng)基

黃漿水培養(yǎng)基：為豆腐壓濾成型后的黃色瀝水，取自北京延慶豆腐廠。MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。以上培養(yǎng)基在121℃條件下高壓蒸汽滅菌20min。

（3）化學(xué)試劑

葡萄糖、無水碳酸鈣、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（色譜純）：北京博奧拓達(dá)公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸提取試劑盒、回收試劑盒、DL3000DNAMarker、TransTaq-TDNAPoly-merase（250U）、10×TransTaq-TBuffer、2.5mmol／L脫氧核糖核苷三磷酸、6×DNALoadingBuffer：美國TransTaq公司。

2、儀器與設(shè)備

YP20001電子大平：上海雷韻實驗儀器制造有限公司；PHS-3CpH計：匕海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-2ND型超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YQX-SG46-280S自動高壓滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TENSUC恒溫培養(yǎng)箱：匕海大呈實驗儀器制造有限公司；TU-1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TGL-16aR高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；1260series高效液相色譜儀：美國Agilent科技有限公司；T1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：美國Bio-Rad公司。

3、實驗方法

（1）酸漿增殖培養(yǎng)

酸漿的活化與增殖培養(yǎng)采用喬支紅等的方法。取5mL酸漿接種于20mL黃漿水培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。

（2）產(chǎn)酸菌株的分離純化

將增殖培養(yǎng)的酸漿經(jīng)無菌生理鹽水梯度稀釋至10^-4、10^-5、10^-6三個梯度，取100μL梯度稀釋液于空白培養(yǎng)皿中，倒入融化井冷卻至45℃左右的含有2%CaCO3的MRS肉湯培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的菌落于MRS固體培養(yǎng)基反復(fù)劃線分離直至出現(xiàn)單菌落，鏡檢后選取符合乳酸菌形態(tài)、無雜菌的菌落接種于MRS斜面培養(yǎng)基于4℃保存。

（3）高產(chǎn)酸菌株的篩選

將每個樣品中分離純化得到的乳酸菌活化后接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)基pH值，選取每個樣品中pH值最低的菌株為該樣品中高產(chǎn)酸菌株。

（4）菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板對菌株的16SrDNA進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增引物為16SrDNA通用引物1492R、27F；PCR擴增體系：10×buffer5μL，10×TransTaq-T0.5μL，引物27F1μL，引物1492R1μL，DNA模板1μL，dNTPs4μL。PCR擴增程序：預(yù)變性10min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，29個循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)PCR擴增片段。將PCR擴增產(chǎn)物用回收試劑盒回收，使用測序儀對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具比對，選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA序列，采用MEGA-X10.1軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

（5）產(chǎn)酸量測定

將活化后的菌種按2%（V／V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)。取樣時間間隔為前12h每隔2h取樣測定；12h后每隔4h取樣測定；24h后每隔12h取樣測定。發(fā)酵液經(jīng)蒸餾水稀釋10倍后，滴加5滴酚酞溶液，用0.1mol／L氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色出現(xiàn)，且30s后不褪色即為滴定終點，記錄NaOH消耗體積，三組平行。以滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基作為空白對照，計算產(chǎn)酸量，其計算公式如下：

X=（V₁-V₂）×C_NaOH×0.09×100／V_樣品X為樣品產(chǎn)酸量（以乳酸計），g／100mL；V₁為樣品消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；V₂為空白培養(yǎng)基消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；C_NaOH為標(biāo)定的氫氧化鈉濃度，g／L；0.09為乳酸的換算系數(shù)。

（6）有機酸組成分析

將活化后的菌種接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)12h。采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行有機酸組成分析。液相色譜條件：色譜柱為CarbomixH-NP10：8%（10μm，7.8×300mm）；流動相為20mmol／LNaH2PO4；進(jìn)樣體積為10μL；流速為1.0mL／min；柱溫為30℃；檢測波長為210nm。

（7）耐酸性測定

以自然pH值的MRS肉湯培養(yǎng)基（pH6.83）作為空白對照，將預(yù)先活化好的菌株按2%（V／V）的接種量分別接種于pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48h，采用分光光度計在波長600nm處測定其OD_600nm值。

（8）耐鹽性測定

將預(yù)先活化好的菌株按2%（V／V）的接種量接種于鹽濃度分別為0、1%、2%、3%、4%、5%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48h，測定其OD_600nm值。

（9）數(shù)據(jù)處理

利用Excel與SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，使用MEGA-X10.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

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