甜葉菊（又名甜菊葉、甜茶、甜菊草等），拉丁名Steviarebaudiana（Bertoni）Hemsl。原產(chǎn)于南美巴拉圭與巴西山脈交界處，近年來(lái)被引進(jìn)中國(guó)江蘇、山東、福建等多地種植。最早在《中草藥》中就有記載，甜葉菊味甘、懷平，主消渴與高血壓病。其使用部位為葉與莖，一年中春夏秋三季均有生長(zhǎng)，種植環(huán)境要求不高，是較容易得到的甜味劑生產(chǎn)原料之一。甜菊糖苷是從甜葉菊中制得的成品，具有甜度高且熱量低的優(yōu)點(diǎn)，目前正逐漸開始代替蔗糖、白糖等甜味劑。且有大量研究表明，甜菊糖苷的二次產(chǎn)物甜菊醇/異甜菊醇可以通過(guò)降低肝臟糖異生基因的表達(dá)、激活肝臟與肌肉中磷酸化酶、拮抗胰島素等作用參與體內(nèi)糖代謝過(guò)程，對(duì)治療二型糖尿病產(chǎn)生積極作用。

大孔樹脂是表面具有多個(gè)孔洞的空心球形顆粒物，屬于高分子材料，具有相互吸附與分子篩的物理原理，常用于污水處理中，現(xiàn)今也常被用于生產(chǎn)原料中有效成分的純化與分離，分為極性與非極性兩種，現(xiàn)市面上常見的分離純化用樹脂多為進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改性樹脂，甜菊糖苷專屬樹脂即非極性改性樹脂。以往甜菊糖苷的相關(guān)研究都只是以含量最高的RA和STE為主，卻并未對(duì)其他幾種甜菊糖苷進(jìn)一步的探究說(shuō)明，而本實(shí)驗(yàn)用LX-T28與LX-T81兩種非極性改性大孔樹脂分別對(duì)包括RA與STE在內(nèi)的七種甜菊糖苷進(jìn)行吸附/解吸研究，主要目的在于為工業(yè)生產(chǎn)甜菊糖苷產(chǎn)品時(shí)選用樹脂材料提供參考依據(jù)，并對(duì)甜葉菊的基礎(chǔ)研究作一定的補(bǔ)充說(shuō)明。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SW-LB32T微量折光糖度計(jì)（上海圓邁貿(mào)易有限公司）；BT100-8數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市中大儀器廠）；1.6×16cm玻璃中低壓層析柱（上海聯(lián)塔儀器有限公司）；ThermoMicroPico17微量臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)THERMOSCIENTIFIC公司）；TE602-L電子分析天平（Sartorius公司）；0.22μmPTFE微孔濾膜和Nylon60.22μm微孔濾膜（天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；50μL進(jìn)樣針（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）。

1.2 試劑與藥物

95%可食用乙醇（鎮(zhèn)江華東器化玻有限公司）；乙腈、甲醇有機(jī)試劑均為HPLC級(jí)（國(guó)藥集團(tuán)有限公司），水為純水/純凈水（哇哈哈牌）；標(biāo)準(zhǔn)品：RD（≥98%，DST190402-069，成都德思特生物技術(shù)有限公司）、Rf（≥98%，DST190802-074，成都德思特生物技術(shù)有限公司）、RA（≥98%，PSO945-O025，成都普思生物科技股份有限公司）、STE（≥98%，PS1416-O025，成都普思生物科技股份有限公司）、RC（≥98%，PS0946-O025，成都普思生物科技股份有限公司）、DA（≥98%，19011422，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）、Rub（≥98%，18112123，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）；精制的甜菊糖苷粉末（≥95%，20181201，江蘇華晶生物科技有限公司）；大孔吸附樹脂LX-T28、LX-T81（西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 檢測(cè)方法

2.1.1 HPLC定性與定量檢測(cè)

色譜條件：色譜柱LunaC18（2），250*4.6，5μm，（00G-4252-E0）；32%乙腈+68%水為流動(dòng)相；DAD檢測(cè)器，210nm檢測(cè)波長(zhǎng)；0.5mL/min流速；20μL進(jìn)樣體積；30℃柱溫。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制甜菊糖苷RD、RA、STE、RF、RC、DA、Rub的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100、200、300、400、500、600μg/mL，并混合成具有各糖苷的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在HPLC色譜條件下分別測(cè)定峰面積響應(yīng)值，繪制濃度（μg/mL）-峰面積曲線圖，分別得到各糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：

RD：y=6.8806x-17.180，r²=0.9982/r=0.9991

RA：y=8.1894x-75.987，r²=0.9987/r=0.9993

STE：y=10.706x-39.765，r²=0.9991/r=0.9995

RF：y=7.2153x-16.006，r²=0.9974/r=0.9987

RC：y=8.0646x-35.212，r²=0.9997/r=0.9998

DA：y=11.086x-6.0582，r²=0.9988/r=0.9993

Rub：y=11.240x-14.160，r²=0.9986/r=0.9992

2.2 樹脂的預(yù)處理

LX-T28與LX-T81兩種樹脂分別先用1～2BV95％可食用乙醇進(jìn)柱，流速1～2BV/h，浸泡過(guò)夜；隨后再用1～2BV95％可食用乙醇洗脫至洗出液與水的混合液（1∶2）不再渾濁，再水沖洗樹脂床直至無(wú)醇味即可投入使用。

2.3 靜態(tài)吸附

分別稱取預(yù)處理后的兩種濕態(tài)樹脂（瀝干至無(wú)水滴落狀，1BV≈22mL）1g，各加入35mL15mg/mL的甜菊糖苷水溶液（精制的甜菊糖苷粉末配制），在室溫（25℃）下中低速度震蕩24h后，HPLC測(cè)定上清液的成分及含量，計(jì)算樹脂的靜態(tài)吸附當(dāng)量。

2.4 靜態(tài)解吸

將‘2.3’中吸附飽和兩種濕態(tài)樹脂用純水清洗盡殘留的甜菊糖苷溶液，再各加入35mL55%乙醇（95%可食用乙醇配制），在室溫（25℃）下中低速度震蕩24h后，HPLC測(cè)定上清液的成分及含量，計(jì)算該洗脫劑下的解吸量。

2.5 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

分別稱取預(yù)處理后的兩種濕態(tài)樹脂（瀝干至無(wú)水滴落狀）1g，各加入35mL15mg/mL的甜菊糖苷水溶液（精制的甜菊糖苷粉末配制），在室溫（25℃）下中低速度震蕩25h，收集1、2、4、6、8、11、25h的上清液，HPLC測(cè)定上清液的成分及含量，繪制樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

2.6 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線

將‘2.5’中吸附飽和兩種濕態(tài)樹脂用純水清洗盡殘留的甜菊糖苷溶液，再各加入35mL55%乙醇（95%可食用乙醇配制），在室溫（25℃）下中低速度震蕩24h，收集1、2、4、6、8、11、25h的上清液，HPLC測(cè)定上清液的成分及含量，繪制樹脂的靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

2.7 泄露曲線/動(dòng)態(tài)吸附曲線

分別稱取20g濕態(tài)樹脂，濕法裝填入1.6×16cm的層析柱中。配制15mg/mL濃度甜菊糖苷水溶液，以2BV/h流速上樣，每15min（即0.5BV）收集一次流出液，HPLC檢測(cè)每次流出液，當(dāng)流出液的濃度達(dá)上樣溶液濃度的10%時(shí)的上樣體積即為即為飽和上樣體積。

2.8 動(dòng)態(tài)解吸曲線

將‘2.7’中吸附飽和的樹脂，中水沖洗干凈殘留的上樣液后，2BV/h洗脫流速，2BV55%乙醇進(jìn)柱洗脫（洗脫劑用完后用純水頂出管路中的解吸液），每15min（即0.5BV）收集一次流出液，HPLC檢測(cè)每次流出液，檢測(cè)洗脫液濃度至‘0’時(shí)，達(dá)到完全解吸的洗脫體積。

2.9 單柱分離

兩種樹脂分別裝填在1.6×16cm層析柱中。配制15mg/mL濃度甜菊糖苷水溶液，以2BV/h流速上樣，待樹脂床吸附飽和后，中水沖洗干凈殘留的上樣液，以2BV/h洗脫流速，2BV55%乙醇進(jìn)柱洗脫（洗脫劑用完后用純水頂出管路中的解吸液），每3min收集一次流出液，HPLC檢測(cè)每次流出液，分析幾種甜菊糖苷的出柱先后順序。

3 結(jié)果與分析

3.1 樹脂性能參數(shù)比較

就工業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，樹脂的吸附當(dāng)量與產(chǎn)品產(chǎn)量呈正相關(guān)趨勢(shì)，因此樹脂的吸附能力常作為評(píng)價(jià)樹脂性能的主要指標(biāo)。通過(guò)比較兩種樹脂的靜態(tài)吸附當(dāng)量，以評(píng)價(jià)樹脂對(duì)于不同甜菊糖苷的吸附性能與綜合吸附性差異。樹脂性能參數(shù)的差異見下表1。

從表1可以看出，LX-T81對(duì)以上七中甜菊糖苷的靜態(tài)吸附當(dāng)量均高于LX-T28，性能更優(yōu)。其中差異最顯著的是含量最高的RA和STE，分別是1g樹脂可以吸附166.05mg和72.33mg。此外，同種樹脂對(duì)不同甜菊糖苷的吸附能力也有較為明顯的差距，這種現(xiàn)象主要源于幾種甜菊糖苷在精制甜菊糖苷粉末中的含量差異，還包括不同甜菊糖苷的分子量、所帶糖基種類與數(shù)目的差異，等等因素，綜合影響樹脂的吸附能力。

3.2 吸附動(dòng)力學(xué)曲線

實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，除了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，吸附速度即達(dá)到樹脂吸附飽和的時(shí)間快慢，也是評(píng)價(jià)樹脂性能的重要參數(shù)之一，見下圖1。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，LX-T28與LX-T81的樹脂吸附動(dòng)力學(xué)曲線的變化趨勢(shì)幾乎完全一致。表現(xiàn)在0～2h內(nèi)七種甜菊糖苷的吸附當(dāng)量隨時(shí)間增加而變大，而在2h后吸附當(dāng)量都趨于穩(wěn)定，說(shuō)明兩種樹脂均為較高效的吸附樹脂，達(dá)到吸附飽和的時(shí)間相近，而曲線中斜率（吸附速度=吸附當(dāng)量/時(shí)間）則表明LX-T81吸附速度稍快于LX-T28。此外，在0～2h內(nèi)，可以明顯發(fā)現(xiàn)七種甜菊糖苷的吸附速度均有較為明顯的差異，依次是RA最快，隨后是STE、RC、RF、Rub、RD，DA最慢。

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《中國(guó)食品添加劑》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：甜菊糖苷，乙醇，乙腈，甲醇