二、結(jié)果與分析

1、優(yōu)化的衍生試劑含量

選擇丹磺酰氯作為衍生劑，其添加量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖1。在丹磺酰氯添加量5～10mg/mL范圍，隨著添加量的增加，各生物胺的峰面積增加；當(dāng)?shù)せ酋Ｂ忍砑恿看笥诘扔?0mg/mL時(shí)，各生物胺峰面積不再隨其添加量的增加而增加，基本保持不變，表明所衍生的生物胺達(dá)到飽和狀態(tài)。選取10mg/mL的丹磺酰氯溶液作為本試驗(yàn)的衍生試劑。

2、優(yōu)化的色譜條件

比較ThermoHypersilGOLDC18柱（柱長(zhǎng)250mm，柱內(nèi)徑4.6mm，柱填料粒徑5μm）與島津InertsilODS-4C18柱（柱長(zhǎng)150mm，柱內(nèi)徑4.6mm，柱填料粒徑5μm）對(duì)各生物胺的分離效果。經(jīng)250mm色譜柱分離后，9種生物胺在37min內(nèi)彼此分離且峰形對(duì)稱。經(jīng)150mm色譜柱分離后，37min內(nèi)色譜圖中只有8種生物胺的流出峰，無(wú)法在37min內(nèi)分離9種生物胺。

3、優(yōu)化的洗脫條件

流動(dòng)相A與B的比例見(jiàn)表1。通過(guò)不斷調(diào)整流動(dòng)相A與B的含量，得到最優(yōu)洗脫程序方案2。采用方案2對(duì)9種生物胺混標(biāo)溶液進(jìn)行洗脫分離，各生物胺流出峰彼此分離效果較好。

4、優(yōu)化的試驗(yàn)方案

比較萃取處理對(duì)生物胺含量檢測(cè)的影響。方案1直接對(duì)生物胺衍生，而方案2在對(duì)生物胺衍生之前進(jìn)行萃取富集處理。選取尸胺、鹽酸吡哆胺與β-苯乙胺3種生物胺，比較萃取處理對(duì)生物胺檢測(cè)效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。分析可知，對(duì)生物胺萃取處理后再衍生，生物胺損失程度減小，在樣品復(fù)雜的基質(zhì)中對(duì)生物胺的檢測(cè)效果更佳，這說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行萃取、凈化的重要性。

5、線性關(guān)系與檢出限

按照所建立的方法，將配制好的梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（50.00，25.00，5.00，1.00，0.50，0.25，0.20，0.10，0.05mg/L）進(jìn)行線性試驗(yàn)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）對(duì)其峰面積（Y）進(jìn)行回歸方程線性擬合，通過(guò)R²進(jìn)行相關(guān)性評(píng)價(jià)。9種生物胺的檢出限（LOD）與定量限（LOQ）通過(guò)3倍信噪比（S/N=3）與10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。優(yōu)化的色譜條件程序洗脫后，混標(biāo)中各生物胺色譜峰圖如圖1所示，各生物胺加標(biāo)黃酒樣品中的色譜峰圖如圖2所示。

由表3可知，9種生物胺在0.5～50mg/L質(zhì)量濃度范圍，該方法具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998。檢出限范圍0.07～0.22mg/L，定量限范圍0.07～0.73mg/L。分析圖1與圖2后發(fā)現(xiàn)37min洗脫與分離后，9種混合生物胺色譜峰先后流出，被成功分離。

6、加標(biāo)回收

選取3種生物胺做加標(biāo)回收試驗(yàn)，向黃酒樣品中加入3種濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)量分別為1.0，5.0，10.0mg/L，其濃度均在線性范圍。用所建立的方法進(jìn)行前處理與測(cè)定，各加標(biāo)水平樣品平行測(cè)定3份，結(jié)果見(jiàn)表4。3種生物胺加標(biāo)回收率在83.30%～114.70%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RＳD）均低于4.56%，說(shuō)明該方法對(duì)生物胺的檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

7、實(shí)際樣品分析

用所建立的方法分析黃酒與白酒中生物胺含量，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。由表5可知，黃酒中含有8種生物胺，總含量為29.39mg/L，各生物胺含量均有差異。色胺與尸胺為該黃酒樣品中的主要生物胺，含量分別為（18.06±0.012）mg/L與（4.28±0.059）mg/L，β-苯乙胺含量為（1.21±0.021）mg/L，腐胺含量為（2.15±0.002）mg/L，鹽酸吡哆胺含量為（2.45±0.028）mg/L，組胺含量為（0.40±0.049）mg/L，酪胺含量為（0.75±0.003）mg/L，亞精胺含量為（0.09±0.003）mg/L，精胺未檢出。白酒檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。白酒中生物胺總含量在3.83～7.94mg/L之間，其中組胺在4種白酒中被檢出，精胺只在一種白酒中檢出，其余7種生物胺在5種白酒中均被檢出。比較黃酒與白酒中各生物胺含量可以發(fā)現(xiàn)，黃酒中的生物胺總含量高于白酒。這與之前研究報(bào)道一致。雖然二者均采用釀造工藝，但是后期工藝不同，黃酒無(wú)需蒸餾處理，而白酒需蒸餾處理，蒸餾后酒體中生物胺含量大大減少。另外，催化氨基酸脫羧轉(zhuǎn)變成生物胺的脫羧酶，在pH4.04～4.33的黃酒釀造過(guò)程中被誘導(dǎo)合成，導(dǎo)致黃酒中生物胺含量相對(duì)較多。

三、結(jié)論

采用HPLC-紫外檢測(cè)法，丹磺酰氯柱前衍生梯度分離洗脫黃酒與白酒中的生物胺，在37min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了兩種酒體中9種生物胺的分離。比較分析黃酒與白酒中生物胺含量，結(jié)果該方法準(zhǔn)確性好，可快速檢測(cè)9種生物胺含量。

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