②反應介質中的電解質：電解質是抗原抗體反應系統(tǒng)中不可缺少的成分，它可使免疫復合物出現(xiàn)可見的沉淀或凝集現(xiàn)象。一般用8.5g／LNaCl溶液作為抗原和抗體的稀釋劑與反應介質，特殊需要時也可選用較為復雜的緩沖液。如果反應系統(tǒng)中電解質濃度低甚至無，抗原抗體不易出現(xiàn)可見反應，尤其不易形成沉淀反應。如果電解質濃度過高，則會出現(xiàn)非特異性蛋白質沉淀。

③反應溫度：溫度對免疫反應的影響顯而易見，溫度過高會使生物分子變性，溫度過低則使生物分子的活性降低或喪失。除了上述較極端的情況以外．抗原抗體的溫度適應能力比較強，一般在15～40℃的范圍內均可以正常進行。在這個范圍內，溫度的變化主要影響反應速度，較少影響反應結果?？乖贵w反應的最適溫度為37℃。

④應時間：時問本身不會對抗原抗體反應主動施加影響，但實驗過程中觀察結果的時間不同可能會看到不同的結果。時間因素主要由反應速度來體現(xiàn)，反應速度取決于抗原抗體親和力、反應類型、反應介質、反應溫度、反應模式等因素。一般免疫分析固液兩相免疫反應達到平衡的時間為1～3h。在優(yōu)化條件或反應促進劑作用下，可縮短免疫反應達到平衡的時間。均相免疫反應比非均相免疫反應達到平衡的速度快得多，一般37℃下反應15rain即可達平衡。

二、免疫分析方法類型

免疫分析方法有多種不同的分類方式，按抗原抗體反應是在固液兩相問還是在單一液相中進行和是否需要進行固液分離，分為非均相免疫分析和均相免疫分析；按抗原抗體結合反應的方式不同，免疫分析可分為非競爭型免疫分析和競爭型免疫分析；按抗原(或抗體)是否進行標記可分為標記免疫分析和非標記免疫分析。

(一)非均相免疫分析

非均相免疫分析通常在固液兩相中進行。以適當?shù)臉擞浳飿擞浛贵w或抗原，將抗原或抗體固定于適當?shù)墓滔噍d體(如聚苯乙烯微孔板)表面，抗原抗體反應體系中同時存在液相中游離的標記物和固相上結合的標記物，兩相的標記物都具有活性。在反應平衡后將固相和液相分離，測定固相上結合狀態(tài)的標記物的活性或液相中游離標記物的活性，推算待測物的含量。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)是目前最常用的非均相免疫測定法。這種測定方法有3種必要的試劑：①包被固相用抗原或抗體，即免疫吸附劑(immunosorbent)；②酶標記的抗原或抗體，稱為酶結合物(conjugate)。

③酶的底物和顯色劑。酶聯(lián)免疫吸附測定法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體。由于抗原抗體反應在兩相間進行，反應到達平衡所需時間長，反應平衡后需要進行兩相分離，故檢測速度慢。

(二)均相免疫分析

均相免疫分析是在均勻體系(通常在液相)中進行的。如可以用適當?shù)臉擞浳?如酶、熒光劑等)標記抗體或抗原，利用抗原抗體反應形成復合物后標記物的活性(如酶活性)受到抑制或其他信號的變化(如熒光偏振、熒光增強、熒光猝滅等)來檢測抗體或抗原，反應后不需要分離結合的標記物和游離的標記物，直接測定系統(tǒng)中的標記物的活性或相關信號的變化，來確定結合的或游離的標記物的數(shù)量，從而得到待測抗原或抗體含量的信息。均相免疫分析不僅可以用于蛋白質等大分子抗原或抗體的測定，也可用于農藥、藥物、激素、毒品、興奮劑等小分子化合物的測定。均相免疫反應達到平衡的速度快，不需要進行兩相分離，方法簡便快速。

(三)非競爭型免疫分析

非競爭型免疫分析主要有雙抗體夾心法、間接法和捕獲包被法。

1、雙抗體夾心法檢測抗原病毒等顆?？乖?、蛋白質等大分子一般具有多個抗原決定簇，對這類抗原的檢測多采用抗不同抗原決定簇的雙抗體夾心法。

①將特異性抗體包被于固相載體。洗滌除去游離的抗體及雜質，封閉固相上未結合抗體的位點。

②待檢抗原，37℃保溫反應，樣品中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體合物，洗滌除去未結合的游離物質。

③加抗另一抗原決定簇的酶標記抗體，37℃保溫反應。固相上的抗原抗體復合物與酶標抗體結合，形成抗體一抗原一酶標抗體三元復合物。徹底洗滌去除未結合的酶標抗體。此時固相上結合的酶標抗體量與樣品中被測抗原量在一定范圍內呈正相關。

④加酶的底物和顯色劑，固相三元復合物上的酶催化顯色劑產(chǎn)生有色產(chǎn)物，樣品中抗原的量與酶促顯色強度呈正比，通過比色測定可對抗原進行定性分析和定量分析。

在實際應用中，如抗體的來源為抗血清，包被和酶標記用的抗體最好分別來自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相和制備酶標抗體。這樣的雙抗體夾心法具有很強的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，進行一步法檢測。

2、間接法檢測抗體間接法檢測抗體的原理。用抗原包被固相，加入待檢樣品和酶標二抗，待測抗體與固相抗原結合，酶標二抗與待測抗體結合，通過檢測酶標二抗的酶促顯色反應來檢測待測抗體。

①將特異性抗原包被于固相。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

②加待測樣品，37℃保溫反應。樣品中的待測抗體與固相抗原結合，形成抗原抗體復合物。洗滌去除樣品中游離的其他成分。

③酶標二抗，固相抗原上結合的待測抗體與酶標二抗結合。洗滌去除游離物。

④加酶的底物和顯色劑顯色，固相上結合的酶標二抗量(酶促顯色反應強度)與樣品中待測抗體量在一定范圍內呈正相關。

參考資料：農藥殘留分析，本文所用圖片、文字版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系。

相關鏈接：電解質，抗體，酶，蛋白質