二氧化硫或其衍生物（亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽）被廣泛地應(yīng)用于葡萄的采摘、釀制過程中，以起到保鮮、殺菌、抗氧化、穩(wěn)定的作用。從古代起，人們便使用硫磺來為葡萄酒殺菌。歐盟法律規(guī)定干紅葡萄酒中SO2的總量上限為160mg/L，干白和桃紅葡萄酒中SO2的含量上限為210mg/L，澳大利亞為250mg/L～300mg/L，新西蘭為250mg/L～400mg/L。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA）規(guī)定當(dāng)葡萄酒中亞硫酸鹽含量超過10mg/L時，必須在標(biāo)準(zhǔn)中予以標(biāo)明。我國對二氧化硫作為葡萄酒的添加劑，在使用量上也有嚴(yán)格的規(guī)定，作為添加劑的使用最高值為250mg/L，二氧化硫殘留量不得超過50mg/L。我國有機(jī)葡萄酒GB/T19630—2011《有機(jī)產(chǎn)品》中規(guī)定，紅葡萄酒的最大使用量為100mg/L，白葡萄酒、桃紅葡萄酒二氧化硫最大使用量為150mg/L。

葡萄酒中添加SO₂，不但會影響葡萄酒的風(fēng)味，而且也對人體健康不利，尤其對過敏體質(zhì)者和哮喘病人會誘發(fā)一些身體問題聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會制定的SO2安全攝入限量是每天每千克體重0.7mg。對于一個60kg的成年人，相當(dāng)于每天攝入量不能超過42mg。針對葡萄酒中亞硫酸鹽的危害問題，Brown利用離子交換樹脂來吸附葡萄酒中的亞硫酸鹽，而Seifter等則采用含固定氧化劑的膜來去除葡萄酒中亞硫酸鹽，這兩種方法都能使葡萄酒中的亞硫酸鹽降到0.01mg/mL以下，但是由于其作用機(jī)制的非選擇性，結(jié)果會造成葡萄酒中一些成分的損失，從而影響葡萄酒的質(zhì)量。Lin等利用從麥苗中提取的葉綠體對葡萄酒中的亞硫酸鹽清除情況進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能夠有效地除去葡萄酒中的亞硫酸鹽，但是需要將葡萄酒的pH值調(diào)至8.5時，去除效率最好，而且該方法對白葡萄酒的處理效果要好于紅葡萄酒，同時發(fā)現(xiàn)光照對去除效果有一定的促進(jìn)作用，顯然該方法存在一定缺陷。

亞硫酸鹽氧化酶能夠?qū)Ｒ恍詫喠蛩猁}氧化成硫酸鹽，但是由于這種酶的復(fù)雜性，目前還未有商業(yè)化生產(chǎn)。葉綠體作為一種天然的生物催化劑，存在于絕大多數(shù)的綠色植物葉片中。葉綠體在一定條件下通過代謝途徑對低濃度的亞硫酸鹽溶液具有良好的氧化并脫除的效果。本研究對從新鮮菠菜中提取的葉綠體內(nèi)含物進(jìn)行了改進(jìn)，并對改進(jìn)后的菠菜提取物去除葡萄酒中的亞硫酸鹽情況進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 原料

紅葡萄酒、白葡萄酒：煙臺張?jiān)Ｆ咸丫朴邢薰?；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、過氧化氫（以上試劑均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
ME204T/02電子天平：梅特勒-托利多公司；H1650-W臺式離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)有限公司；101型真空干燥機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 菠菜提取物的制備

選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈，擦干后去除葉梗，用高速組織破碎機(jī)破碎成勻漿，6層紗布過濾除去粗纖維，所得濾液于4℃、10000r/min離心10min，收集含葉綠體的內(nèi)容物（線粒體、溶酶體、微體）的沉淀，真空干燥、復(fù)配、密封、干燥處保藏、備用。

1.3 葡萄酒中二氧化硫的測定

按照國標(biāo)GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中SO₂的測定方法進(jìn)行測定。

1.4 葡萄酒中二氧化硫去除單因素試驗(yàn)

分別取50mL葡萄酒置于250mL的三角瓶中，然后測定菠菜提取物在不同使用量、處理時間、pH值和酒精度等各種條件下二氧化硫的去除情況。其中，試驗(yàn)過程中葡萄酒pH值的調(diào)整用0.1mol/L的氫氧化鈉進(jìn)行，除非特別說明，所有試驗(yàn)均在25℃室溫條件下進(jìn)行。

1.5 葡萄酒中二氧化硫去除正交試驗(yàn)

在葡萄酒中二氧化硫去除單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計，選取菠菜提取物用量0.3、0.4、0.5mg/mL；處理時間4、6、120min；pH值3.5、7.0、9.0；和乙醇濃度12.5%、22.5%、27.5%，為自變量，以1、2、3水平進(jìn)行編碼，以總二氧化硫清除率為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計見表1。

1.6 去硫葡萄酒的感官評價

葡萄酒的感官品質(zhì)包括葡萄酒的外觀、香氣、滋味以及是否具有典型性，因酒齡、品種、種植條件的不同，葡萄酒帶給人的感覺也千變?nèi)f化，本研究對去除二氧化硫后的葡萄酒進(jìn)行感官評定，感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)利用正交設(shè)計助手II和SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P>0.05為差異不顯著；P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著。

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