1.4法蘭克福香腸人工污染單核細(xì)胞增生李斯特菌

取同批號待檢法蘭克福香腸6～7袋，搓揉外包裝，使內(nèi)容物與液體充分接觸。無菌開啟包裝，取浸出液40mL（每袋約6mL），混勻，作為待測樣，置4℃保存。人工污染前，取1mL浸出液通過增菌培養(yǎng)法檢測待測樣。選擇未受李斯特菌屬污染的待測樣，接種新鮮培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特菌（AＴCC19115），使其終濃度約為＜1CFU/mL、1CFU/mL、10CFU/mL和100CFU/mL。污染后將樣品置4℃穩(wěn)定24h，模擬食用前的微生物存活狀態(tài)。

1.5法蘭克福香腸人工污染單核細(xì)胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌

取40mL待測樣，分別接種新鮮培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特菌AＴCC19115（LM）和英諾克李斯特菌AＴCC51742（LI）。菌液終濃度LM/LI的比例分別為1/1，1/10，1/100，1/1000，10/10，10/100，10/1000，100/10，100/100和100/1000。污染后將樣品置4℃穩(wěn)定24h。

1.6目標(biāo)菌的磁珠捕獲與菌落計數(shù)

1.6.1 BHI培養(yǎng)基中磁珠的捕獲效率

分別將3株單核細(xì)胞增生李斯特菌和6株其它李斯特菌屬細(xì)菌接種至BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)（表3），制成約105CFU/mL菌液。取上述菌液1mL，分別加入20μL免疫磁珠溶液，4℃輕微振蕩1h。用PBS緩沖液在磁力架上清洗3次，用1mL相同的緩沖液重懸，必要時進行10倍系列稀釋。以6×6滴板計數(shù)法（每滴10μL）在BHI瓊脂培養(yǎng)基上計數(shù)，比較磁珠捕獲前后微生物的數(shù)量變化。

1.6.2法蘭克福香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測

以USDA-FSIS檢測方法為基礎(chǔ)（MicrobiologyLaboratoryGuidebook，MLG8.1），結(jié)合磁珠捕獲和PCR確認(rèn)技術(shù)，檢測法蘭克福香腸中的單核細(xì)胞增生李斯特菌。取第1次增菌的UＶM培養(yǎng)基（Modifieduniversityofvermontbroth）90mL，加入10mL人工污染浸出液，置（30±2）℃振蕩160r/min培養(yǎng)（22±2）h。分別取0.1mLUＶM培養(yǎng)物至第2次增菌的10mLFB培養(yǎng)基（Fraserbroth）和10mLMOPS-BLEB培養(yǎng)基（Morpholinepropanesulfonicacidbufferedlisteriaenrichmentbroth）中，置（35±2）℃振蕩250r/min培養(yǎng)（26±2）h。取上述UＶM、FB和MOPS-BLEB培養(yǎng)物各1mL，分別加入scFv-IMBs和Dyna-IMBs溶液20μL，按1.6.1節(jié)的方法分別在BHI瓊脂和顯色瓊脂上計數(shù)。剩余的磁珠捕獲液用于顯色培養(yǎng)基劃線和細(xì)菌基因組DNA提取。

2結(jié)果

2.1BHl培養(yǎng)基中磁珠的捕獲效率

采用9株細(xì)菌考察BHI培養(yǎng)基中兩種磁珠的特異性。scFv-IMBs對3株單核細(xì)胞增生李斯特菌的捕獲率在15%～55%之間，高于同種培養(yǎng)基中Dyna-IMBs的0.85%～1.27%捕獲率。scFvIMBs除對斯氏李斯特菌和伊氏李斯特菌的捕獲率略高于Dyna-IMBs外，對李斯特菌屬中非單核細(xì)胞增生李斯特菌的捕獲率均低于0.61%。在BHI純培養(yǎng)系統(tǒng)中，scFv-IMBs顯示出良好的特異性和較高的捕獲率。

2.2備選PCR引物的驗證

為了從5種備選的引物中選擇出單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性PCR檢測引物，針對23株待測微生物進行PCR引物驗證。引物L(fēng)mo0733具有李斯特菌屬水平特異性；格式李斯特菌干擾引物Aznar的檢測；威爾斯李斯特菌、格式李斯特菌和部分英諾克李斯特菌干擾引物Ｊaton的檢測。經(jīng)試驗確認(rèn)的單核細(xì)胞增生李斯特菌種水平的特異性為引物Fluit和Nied（表1），這兩對引物目標(biāo)靶點是對李斯特菌溶血素O基因（hlyA）。由于引物Nied在51℃退火時具有較高的檢測靈敏度，可檢測到約2.86pg的單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組（數(shù)據(jù)未列出），被用于后續(xù)試驗的PCR檢測中。

2.3法蘭克福香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測

在BHI和顯色培養(yǎng)基上計數(shù)的菌落數(shù)（或典型菌落數(shù)）分別代表了樣品經(jīng)UＶM、FB或MOPS-BLEB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，所有微生物的總數(shù)和單核細(xì)胞增生李斯特菌的數(shù)量。法蘭克福香腸浸出液經(jīng)增菌培養(yǎng)后，背景菌的濃度可達(dá)到10⁷～10⁸CFU/mL，而單核細(xì)胞增生李斯特菌的濃度約為10²～10⁴CFU/mL，背景菌在培養(yǎng)物中占據(jù)主導(dǎo)地位（表4）。由于高濃度背景微生物影響磁珠與目標(biāo)微生物的結(jié)合，導(dǎo)致在第一步UＶM培養(yǎng)基中兩種磁珠的捕獲率均低于5%，甚至無法在瓊脂平板上分離獲得目標(biāo)菌。經(jīng)FB和MOPS-BLEB培養(yǎng)基二次增菌后，單核細(xì)胞增生李斯特菌的比例由第1次增菌前不足0.01%（濃度小于10⁴CFU/mL）迅速提升到20%～80%（濃度約為10⁶～10⁸CFU/mL），而背景菌的數(shù)量未見顯著增加（表4）。其中，經(jīng)MOPS-BLEB培養(yǎng)后李斯特菌屬細(xì)菌的終濃度會高于FB培養(yǎng)基，并成為體系內(nèi)優(yōu)勢菌，具有較好的選擇培養(yǎng)性。

采用scFv-IMBs和Dyna-IMBs兩種磁珠捕獲后，通過顯色培養(yǎng)基和PCR檢測證實，磁珠捕獲方法對單核細(xì)胞增生李斯特菌的靈敏度可達(dá)1CFU/mL。兩種磁珠在MOPS-BLEB培養(yǎng)基中的捕獲率（62%～88%）明顯高于UＶM培養(yǎng)基（＜5%）和FB培養(yǎng)基（＜53%）中的捕獲率。

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